プロテインチロシンフォスファターゼが調節するチロシンキナーゼのクローニング

1999 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 11771193
• Research Institution: Nihon University
• Principal Investigator: 橋爪 英城 日本大学, 松戸歯学部, 助手 (10256894)
• Keywords: エクスプレッションクローニング / YopH / HCK

Research Abstract

1.HCKのクローニング:GST-YopHをプローブとしてhuman leukocyte λgt11 cDNAライブラリーのエクスプレッションクローニングを行ったところ、Srcファミリーに属するHCKがYopHの相互作用たんぱく質としてクローニングされた。
2.HCKエクスプレッションベクターの構築:YopH-HCKの細胞内相互作用を免疫沈降法で確認するため、各種HCK(SH2,SH3)をPCR法によって増幅しpFLAG-CMV-2エクスプレッションベクターに組み込んだ。PCRに用いたテンプレートはエクスプレッションクローニングで精製されたfull length HCKを用いた。
3.Proline rich sequece mutant YopHの作成:YopHのタンパク質相互作用を示す4箇所のプロリン(160、161、163、164)をPCR法によってアラニンに置き換えた。Constructは免疫沈降に用いるため、Double T7 tagged CMV expression vectorに構築した。
4.ヒトU937細胞内HCKとYopHの相互作用:YopHにタンパク質相互作用を示すproline-rich sequenceが存在することから、同部位を含むもの(aal-170)と含まない(aal-111)それぞれのデリーションミュータントを作成し、ヒトU937細胞内HCKとの相互作用をco-precipitationによって確認した。その結果proline rich sequenceを含むYopHのみがHCKと結合体を作ることが証明された。