ミトコンドリアに存在するATP依存性プロテアーゼLonの構造と機能の解析

1999 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 11780459
• Research Institution: National Cancer Center Research Institute and Research Center for Innovative Oncology, National Cancer Center Hospital East
• Principal Investigator: 村松 知成 国立がんセンター, 研究所・生物物理部, 室長 (70212256)
• Keywords: ATP依存性プロテアーゼ / マウス / ミトコンドリア / 高度好熱菌 / 結晶化

Research Abstract

Lonプロテアーゼはタンパク質の分解と共役してATPを加水分解するATP依存性プロテアーゼの一種で,大腸菌などの原核生物からヒトなどの高等哺乳動物に至るまで広くその存在が知られている.原核生物においては細胞質内,真核生物においてはミトコンドリア内に存在し,変性タンパク質の除去の他に細胞分裂,細胞壁合成の制御(原核生物)やミトコンドリアの機能維持(真核生物)に関わっていることが示唆されている.本研究では,哺乳動物のミトコンドリアにおけるLonプロテアーゼの機能解析を行うとともに,Lonプロテアーゼ自体のATP依存的ペプチド結合切断メカニズムの立体構造レベルでの解明をめざした.本年度は以下の結果を得た.
既に報告のあるヒトのLON遺伝子をプローブとして,マウスcDNAライブラリーよりマウスLON cDNAを得た.このマウスLonとGFPとの融合タンパク質を培養細胞COS7に導入し,ミトコンドリアへ移行することを確認した.次いでLonのN末端付近の部分欠失変異体とGFPとの融合タンパク質を数種,培養細胞内で発現させ,細胞内局在を調べることにより,これまで不明であったLonのミトコンドリア移行シグナルの同定に成功した.現在,Lonプロテアーゼおよびそのプロテアーゼ活性を欠失した変異体を培養細胞に導入し,その機能を解析している.
LonプロテアーゼのATP依存的ペプチド結合切断メカニズムならびに細胞内変性タンパク質認識メカニズムの詳細な解析にはX線結晶構造解析によるLonプロテアーゼの立体構造の解明が不可欠である.そこで,結晶化に有利と思われる高度好熱菌のlon遺伝子のクローニングを行い,それの大腸菌内での大量発現とLonの精製に成功した.この高度好熱菌Lonは基質特異性,ペプチド結合切断反応のATP依存性など,生化学的特性については大腸菌や哺乳動物のものとほぼ同じで,耐熱性が上昇していた.この発現・精製系を用いて1リットルの培養液より約5mgの精製Lonプロテアーゼを得られることがわかったので,現在,この精製標品を用いてX線結晶解析に向けての結晶化の条件検討を行っている.

Research Products

• [Publications] Satoru Watanabe: "Molecular cloning of the Lon protease gene from Thermus thermophilus HB8 and characterization of its gene product"European Journal of Biochemistry. 266. 811-819 (1999)
• [Publications] Toshihiro Mochizuki: "Physical and Functional Interactions between Pim-1 Kinase and Cdc25A Phosphatase. Implications for the Pim-1-Mediated Activation of the c-Myc Signaling Pathway"Journal of Biological Chemistry. 274. 18659-18666 (1999)