分裂酵母RNAポリメラーゼIIの遺伝子組換え蛋白質による再構成

1999 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 11780499
• Research Institution: National Institute of Genetics
• Principal Investigator: 木村 誠 国立遺伝学研究所, 分子遺伝研究系, 助手 (00290891)
• Keywords: RNAポリメラーゼII / 分裂酵母 / 蛋白質相互作用 / バキュロウイルス

Research Abstract

分裂酵母RNAポリメラーゼII(Pol II)は、Rpb1-Rpb12の12種のサブユニット蛋白質によって構成される。このうちRpb4を除く11種のサブユニットをコードするcDNAの1つまたは二つを組み込んだバキュロウイルスを作製し、これらを組み合わせた共感染により、サブユニット蛋白質を任意の組み合わせで、培養昆虫細胞内に発現させることに成功した。その際、発現細胞内で構成されたサブユニット複合体を容易に単離するため、Rpb3をグルタチオン-S-トランスフェラーゼとの融合蛋白質として発現し、Rpblにはヒスチヂンタグ配列を付加した。11種のサブユニットを共発現した細胞抽出液からのグルタチオンアフィニティー、ニッケルイオンアフィニティーによる蛋白質の精製により、Rpb1,2,3,5,7,8,11の7サブユニットによる複合体が単離された。この共発現系からRpb3を除外すると、Rpb11の複合体への結合が低下した。したがって、Rpb11は、Rpb3との相互作用によりPol IIに集合すると考えられる。また、Rpb3とその他のサブユニット1種ずつの共発現により、Rpb1,2,5,7,8,11は、それぞれ、Rpb3と直接相互作用することが明らかとなった。さらに、Rpb3を含む3種類のサブユニットの共発現により、Rpb11のRpb3への結合によりRpb3-Rpb8の相互作用が強化され、Rpb8により、Rpb1-Rpb3の相互作用が強化されることを見いだした。以上の様に、Pol IIのサブユニット集合過程では、サブユニット間の多重相互作用が重要であると考えられる。今後は、発現系および精製方法に改良を加えて、完全なPol IIの再構成を目指す。

Research Products

• [Publications] Hitomi Sakurai: "The Rpb4 subunit of fission yeast Schizosaccharomyces pombeRNA polymerase II is essential for cell viability and similar in structure to the correponding subunits of higher eukaryotes"Molecular and Cellular Biology. 19-11. 7511-7518 (1999)
• [Publications] Makoto Kimura: "Involvement of multiple subunit-subunit contacts in the assembly of RNA polymerase II"Nucleic Acids Research. 28-4. 952-959 (2000)