サンショウウオにおける性染色体の分化並びに形態変化に関する基礎的研究

1999 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 11833016
• Research Institution: Toho University
• Principal Investigator: 河野 晴一 東邦大学, 理学部, 教授 (70057644)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 池部 千賀子 東邦大学, 薬学部, 講師 (30112907)
• Keywords: 性染色体 / 異型性 / 反復性DNA / マイクロディセクション / チョウセンサンショウウオ / PCR / サザンブロットハイブリダイゼーション / W染色体

Research Abstract

チョウセンサンショウウオは28対の染色体対を有し、Cバンド法により済州島に生息する個体が雌異型性の性染色体を有することが示され、採集地点によりW染色体の形状が異なることも観察されている(池部未発表)。この種における異形対の成立は、W染色体における高頻度反復DNAの増幅が直接の原因と想定できる。よって、性染色体の分化の解明に資するために、W染色体の高頻度反復DNAの単離を試みた。高頻度反復DNAはCバンド陽性部位に存在するヘテロクロマチン領域を形成しているとされる。本研究では、城板岳産の個体のギムザ染色された中期核板中のW染色体(特異な形状を持ち容易に識別可能)から、マイクロディセクション法によって、ヘテロクロマチン領域であるサテライト部分と動原体領域を回収した。回収された染色体を酵素処理後、二段階DOP-PCR法によってそのDNA断片を増幅させ、PCR産物がサンショウウオDNA由来であることをサザンブロットハイブリダイゼーションで確認した。結果として、W染色体を削ったPCR産物とポジティブコントロールにシグナルの確認ができ、スライドグラスの表面を削ったPCR産物とネガティブコントロールにはシグナルが確認されなかった。しかし、産物の量的な問題のためクローニング以降の操作に進むことは困難であった。そのため、三段階DOP-PCR法を試みたところ、サザンブロットハイブリダイゼーションにおいてポジティブコントロールにはシグナルが確認されたが、W染色体を削ったPCR産物には確認されなかった。原因の一つとして、サンプルの固定からマイクロディセクションまでの経過時間の長さが考えられる。
産卵期の3月に代表者と分担者で済州島へチョウセンサンショウウオの生体と卵の採集に出かけ、生体14個体(雌:6、雄:8)卵嚢13個を採集して次年度に備える材料とした。