核内ホルモンレセプターを用いた内分泌かく乱物質の人体へのリスク評価系の開発

1999 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 11839021
• Research Institution: Yokohama City University
• Principal Investigator: 土井 陸雄 横浜市立大学, 医学部, 教授 (70091585)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 松井 三明 横浜市立大学, 医学部, 助手 (00285115) ; 鹿島 勇治 横浜市立大学, 医学部, 助手 (50233705) ; 岡部 とし子 横浜市立大学, 医学部, 講師 (20152564)
• Keywords: 甲状腺ホルモンレセプター / レチノイン酸Xレセプター / ホルモンレスポンスエレメント / 内分泌かく乱物質

Research Abstract

内分泌かく乱物質の作用を評価するバイオアッセイ系は、エストロゲンαレセプターを介するものが主である。しかしながら、内分泌かく乱物質の作用は現在わかっている以外にも複数のホルモン応答系に影響を及ぼすことが考えられ、より広く詳細な評価系の確立が急務である。そこで、現在までバイオアッセイ系が報告されていない核内レセプタースーパーファミリーに属する甲状腺αレセプター及びレチノイン酸Xレセプターを用いた系の確立を試みた。はじめに、両レセプター遺伝子に特異的なプライマーを合成し、種々のcDNAライブラリーを用いてPCR法により各々の遺伝子を増幅させた。さらに、甲状腺αレセプターはその下流にFLAG epitope tagを、レチノイン酸XのαレセプターはHA epitope tag、レチノイン酸Xのβ及びγレセプターはmyc epitope tagを付加した後、CMVプロモーターの下流に接続した真核細胞発現プラスミドを構築した。これらプラスミドはネオマイシン耐性遺伝子もSV40プロモーター下流に接続されているため、マウスNIH3T3細胞及びヒトHeLa細胞へ導入した後、G418で選択し、クローニングシリンダーを用いて耐性細胞を単離した。また、甲状腺ホルモンレスポンスエレメント及びレチノイン酸Xレセプターレスポンスエレメントとに共通のDNA配列を合成し、ルシフェラーゼ遺伝子の上流に挿入した。さらに、昨年、甲状腺ホルモンレセプター及びレチノイン酸Xレセプターに特異的な転写因子NRIF3が報告されたので、これについても特異的はプライマーを合成し、種々のcDNAライブラリーを用いてPCR法により増幅させた。現在、甲状腺ホルモンレセプター及びレチノイン酸Xレセプターの高発現株を確認しており、さらに、転写因子、NRIF3及びレポーターのルシフェラーゼ遺伝子を含む発現プラスミドを導入する予定である。