Cre-loxP系を応用した哺乳動物胚における新しい細胞系譜解析法の開発

1999 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 11876060
• Research Institution: Tokai University
• Principal Investigator: 木村 穣 東海大学, 医学部, 教授 (10146706)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 佐藤 正宏 東海大学, 総合医学研究所, 助教授 (30287099)
• Keywords: Cre / loxP系 / EGFP / lacZ / 細胞系譜 / マウス / 着床前胚 / 胚盤胞 / レポーター遺伝子

Research Abstract

[序論]ホヤやウニや両生類等の動物胚における細胞系譜解析には、主に標識物質を細胞に注入する方法が用いられて来た。しかし、母体の中で胚が成長し、しかも胚の著しい成長を伴う哺乳動物胚では、発生と共に細胞に注入された標識物質が希釈されてしまうため、標識物質を細胞に注入する方法では支障があった。本実験では、Cre/loxP系がマウス胚細胞の細胞系譜解析に応用出来ないかどうかを検討した。
[方法]tester遺伝子として、pCETZ-17[CAG(cytomegalovirus enhancer/chicken β-actin promoter),loxP/EGFP(enhanced green fluorescent protein)cDNA-CAT(chloramphenicol acetyltransferase)gene/loxP,lacZ(β-galactosidaseをコード)を内蔵]を構築した。Cre発現ベクターとしてpCAG/NCre(CreのN末に核移行シグナルがを有する)を構築した。pCETZ-17が細胞内に導入されると、CAG promoterの影響でその下流側のEGFPが発現されるが、EGFP自体mRNAの転写を停止させるpoly(A)部位を持つので、転写はそこで停止し、EGFPの下流側にあるlacZは発現しない。即ち、細胞は自家発光するが、β-galactosidaseの基質であるX-Gal存在下では、青く染色されない。しかし、細胞内にCre酵素があると、Cre酵素はloxP配列を特異的に識別し、loxP配列に挟まれた領域が除去され、lacZがCAG promoterの影響により接続的にしかもubiquitousに発現されるようになる。この時、細胞は自家発光はせず、X-Gal染色により青染されると予想される。
[結果/展望]このような原理を踏まえ、pCETZ-17単独あるいはpCETZ-17+pCAG/NCreをマウス受精卵核に注入し、1日培養後、2-cell期に発光及びX-Galによる染色を施した。その結果、理論通りになり、Cre/loxP系がうまく働くことが判った。次いで、pCETZ-17を受精卵核に注入した後、1日目に両方の割球に発光を示す2-cell胚のみを回収し、その片側割球の核にpCAG/NCreを注入した。注入後、1日、2日と培養し、4-cell期、8-cell期における発光とlacZ活性を調べた。その結果、DNAを注入された細胞の子孫のみがlacZ活性を示し、胚の半分が青染された。同様の現象は、CETZ-17を導入されたtransgenicマウス由来の着床前胚にも見られ、Cre/loxP系がマウスのような哺乳動物胚の細胞系譜解析に頗る有効な系であることが示された。今後は、CETZ-17transgenic mouse由来の着床前胚に対し、特に、胚盤胞に着目し、その構成細胞にpCAG/NCreを注入し、注入された胚盤胞を仮親子宮に移植することにより、細胞の系譜をin vivoで追跡する予定。

Research Products

• [Publications] M. Sato: "Cre-loxP System Confers Cell Lineage-Specific Expression of a Reporter Gene in Murine Preimplantation Development"Journal of Reproduction and Development. 45・6. 411-417 (1999)
• [Publications] M. Sato: "A New Approach to Cell Lineage Analysis in Mammals Using the Cre-loxP System"Molecular of Reproduction and Development. (in press).