Cre-loxP系を応用した哺乳動物胚における新しい細胞系譜解析法の開発

2001 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 11876060
• Research Institution: Tokai University
• Principal Investigator: 木村 穣 東海大学, 医学部, 教授 (10146706)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 佐藤 正宏 東海大学, 総合医学研究所, 助教授 (30287099)
• Keywords: Cre-loxP系 / EGFP / lacZ / 細胞系譜 / マウス / 着床前胚 / レポーター遺伝子

Research Abstract

本実験はCre/loxP系を応用し、哺乳動物胚における細胞系譜解析の可能性を検討することを目的とする。既にtesterマウス系統として、CETZ-17 transgene[CAG(cytomegalovirus enhancer/chicken β-actin promoter),loxP/EGFP(enhanced green fluorescent protein)cDNA-CAT(chloramphenicol acetyltransferase)gene/loxP,lacZ gene(β-galactosidaseをコード)を内蔵]を有するtransgenic mouse(Tg)系統155-4を得た。この系統由来の着床前胚、例えば、2-cell胚の一つの割球の核にCre発現ベクターを顕微注入し、発生した4-to 8-cell胚をlacZの基質であるX-Gal存在下で染色すると胚の半分の細胞は青染された。これは、Creの発現でCETZ-17 transgene内のloxPで挟まれたEGFP-CAT配列が除去され、その下流側にあったlacZ遺伝子がCAG promoterの影響で発現するようになったことを意味し、本系が細胞系譜解析に活用出来ることが判明した(Sato et al.,Mol.Reprod.Develop.53,34-44,2000)。更に、CETZ-17Tg由来の胚におけるCre-loxP系を介したlacZ reporter遺伝子の発現誘導は、CETZ-17マウスとCreを脳特異的に発現するMNCEマウス系統(Sato et al.,Mol.Reprod.Dev.60,446-456,2001)とを掛け合わせることにより、着床後期でも、adult organでも起こることが確認され、本系の有効性が再確認された。
本課題の一つは、マウス胚の着床前後における細胞系譜の解析にある。着目したのは、8-cell胚。8-cell胚は未だ分化全能性を示し、決定は行われていないとされる。しかし、16-cell胚になると、胚の外側に面した割球は将来栄養外胚葉細胞(TE)に分化し、胚の内側に入った割球は将来の胚体になる内部細胞塊(ICM)へ分化すると言われている。その分岐は、8-cell胚割球が横に分裂するか、縦に分裂するかに依存する。前者では、全ての嬢細胞がTEになり、後者では一つ(外側に面した割球)がTE、もう一つ(内側に面した割球)はICMとなる。8-cell胚の一つの割球の核にCre発現ベクターDNAを顕微注入し、翌日胚盤胞期をX-Galで染色すると、検討した胚全てが栄養外胚葉細胞の青染を示した。このことは、8-cell胚の割球の殆どは栄養外胚葉細胞への分化へ進む分裂の仕方、即ち、横方向への分裂をすると思われる。8-cell期では16-cell期へ分裂する間、横の分裂が最初に起こり、その後からICM細胞を作る縦の分裂が起こる可能性が示唆された。

Research Products

• [Publications] M.Sato: "Intrabursal transfer of spermatozoa(ITS):A new route for artificial insemination of mice"Theriogenology. 55. 1881-1890 (2001)
• [Publications] M.Sato: "Usefulness of double gene construct for rapid identification of transgenic mice exhibiting tissue-specific gene expression"Molecular Reproduction and Development. 60. 446-456 (2001)
• [Publications] K.Isoda: "Myocardial hypertrophy in transgenic mice overexpressing human interleukin 1α"Journal of Cardiac Failure. (in press). (2001)
• [Publications] M.Sato: "Direct injection of foreign DNA into mouse testis as a possible in vivo gene transfer system via epididymal spermatozoa"Molecular Reproduction and Development. 61. 49-56 (2001)