1999 Fiscal Year Annual Research Report
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11877002
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| Research Institution | Kanazawa University |
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Principal Investigator |
井関 尚一 金沢大学, 医学部, 教授 (50167251)
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| Keywords | 遺伝子転写 / in situハイブリダイゼーション / RNAseプロテクション / 3T3細胞 / 脂肪細胞転化 / GPDH |
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| Research Abstract |
通常の in situ ハイブリダイゼーション(ISH)法では,プローブの側をRI標識するので,検出されるシグナルはすでに細胞質に存在するmRNAを表している。本研究では細胞のRNAの側をRI標識したISHにより,その時点での遺伝子の転写そのものを検出することを試みた。マウス3T3-L1細胞株をインスリン等含有培地で脂肪細胞に分化誘導した後,^3H-ウリジンを1時間取り込ませて固定した。脂肪細胞に特異的に発現するグリセロール-3-リン酸脱水素酵素(GPDH)のmRNAに相補的なリボプローブをジコキシゲニンにより標識し,固定細胞との間でISHを行い,RNAse処理により交雑しなかったRNAを分解して洗い流した後にオートラジオグラフィーで放射活性を検出した。まずジゴキシゲニンの検出により,分化細胞がGPDHリボプローブと反応していることを確認した。ISHを行わない細胞では核の放射性シグナルはRNAse処理によりほとんど消失した。分化細胞において、アンチセンスプローブと反応させてからRNAse処理した場合はセンスプローブによる反応の場合より有意に多くのシグナルが得られた。またアンチセンスプローブによる反応において、分化細胞では分化しない細胞より有意に多くのシグナルが得られた。これらの結果は、プローブと交雑したRNAがRNAseによる分解をまぬがれる現象を利用して,ある時点での特定の細胞による特定の遺伝子の転写を「in situ RNAseプロテクション法」により組織標本上で検出できる可能性を示した(第105回の日本解剖学会で発表予定)。
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