アデノウイルスベクターを用いた心筋イオンチャネル病の病態解明

1999 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 11877008
• Research Institution: Sapporo Medical University
• Principal Investigator: 當瀬 規嗣 札幌医科大学, 医学部, 教授 (80192657)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 蒔田 直昌 北海道大学, 大学院・医学研究科, 助手 (00312356)
• Keywords: QT延長症候群 / アデノウイルス / 遺伝子導入 / イオンチャネル / Na チャネル / 心筋細胞 / パッチクランプ

Research Abstract

本年度はまず、アデノウイルスベクターを用いた心筋細胞へ遺伝子導入法の最適条件を決定するために、成熟モルモット単離心筋細胞にLacZ遺伝子を組み込んだアデノウイルスを感染させた。遺伝子発現効率は感染48時間後にピークとなり、10moiのウイルス力価により約50%の細胞が感染した。次に組換えアデノウイルスの作成を行った。正常型(WT)およびLQT3変異(ΔKPQ)心筋NaチャネルcDNAをアデノウイルスコスミドpAxCAwtにサブクローニングし、組換えコスミドDNAをHEK293細胞にトランスフェクションした。相同組換えにより組換えアデノウイルスゲノムが作成されれば、培養した細胞はウイルス増殖により通常15〜18日で死滅するが、われわれの実験では死滅細胞をみとめたクローンはごく少数で、増殖に成功したウイルス液も目的の組換えアデノウイルス遺伝子を持っていなかった。現在の段階では、残念ながら、組換えコスミドDNAは作成できたものの、組換えアデノウイルスの作成には至らなかった。その原因は、Naチャネル遺伝子が6kbと大きすぎて細胞内で組換えウイルス生成が困難であったためと考えられる。このため、当初の実験計画を変更し、LQT1の原因遺伝子であるKvLQT1のcDNA(約2kb)を用いていることを計画している。正常、および2種類のLQT1変異KvLQT1(臨床的に軽症型のR555C、重症型のG314S)cDNAをコスミドベクターへにサブクローニングはすでに終了し、現在、これらの組換えアデノウイルスの作成を行っている。