1999 Fiscal Year Annual Research Report
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11877020
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| Research Institution | Tokyo Medical and Dental University |
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Principal Investigator |
萩原 正敏 東京医科歯科大学, 難治疾患研究所, 教授 (10208423)
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| Keywords | apoptosis / caspase / PARP |
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| Research Abstract |
PARPのcaspaseによる切断部位をgreen fluorescent protein(GFP)とblue fluorescent protein(BFP)の間のpeptide linkerとして発現するよう組み込んだベクターを構築した。peptide linker内のcaspase切断部位であるDEVDG(in PARP wt)にアミノ酸のDA置換を行い(in PARP mut)、これをcaspase insensitiveなネガティブコントロールとした。さらに、linker内、核局在化シグナル(NLS:nuclear localization siganal)にアミノ酸置換を行い、発現タンパクが細胞内でそれぞれ核(NLS wt)、および細胞質(NLS mut)に局在するようにベクターを構築した。大腸菌タンパク発現用としてpETPARP wt NLS wt,pETPARP wt NLS mut,pETPARP mut NLS wt,pETPARP mut NLS mut,哺乳動物発現用としてpcDNA3PARP wt NLS wt,pcDNA3PARP wt NLS mut,pcDNA3PARP mut NLS wt,pcDNA3PARP mut NLS mutをそれぞれ構築した。前者による、pET systemを用いたリコンビナントタンパクの発現は、予想される分子量(約70KDa)を、CBB染色ならびに、抗GFP抗体を用いたウエスタンブロッティングで確認した。同様に、哺乳動物細胞でも、Hela細胞、COS細胞、NIH3T3細胞に発現ベクターをトランスフェクション後、発現タンパクを抗GFP抗体でウエスタンブロッティング、さらに細胞染色により、その予想される分子量(約70KDa)ならびに細胞内局在を確認できた。
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[Publications] Nagai Y, Miyazaki M, Aoki R,, Zama T, Inoue S, Hirose K, Iino M, Hagiwara M: "Detection of CAMP-induced Phosphorylation with a novel fluorescent indicator."Nat. Biotechnol.. (in press). (2000)
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[Publications] Sakaguchi H, Wada K, Maekawa M, Watsuji T, Hagiwara M: "Song Induced Phosphorylation of CAMP Response Element Binding Protein in the songbird brain."J. Neurosciense. 19. 3973-3981 (1999)
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[Publications] Koizumi J, Okamoto Y, Onogi H, Maekawa A, Krainer A, Hagiwara M: "The Subcellular localization of SF21ASF is regulated by the direct interaction with SR Protein Kinase (SRPKs)"J. Biol. Chem.. 274. 11125-11131 (1999)
