1999 Fiscal Year Annual Research Report

単一細胞RLCS法を用いた神経細胞虚血耐性関連遺伝子の探索

Research Project

Project/Area Number	11877180
Research Institution	Kyoto Prefectural University of Medicine
Principal Investigator	伏木信次京都府立医科大学, 医学部, 教授 (80150572)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	矢追毅京都府立医科大学, 医学部, 助手 (40311914) 福山隆一京都府立医科大学, 医学部, 講師 (60199271)
Keywords	神経細胞 / 虚血 / 遺伝子 / ミトコンドリア
Research Abstract	本研究では、mtDNA欠失細胞(rho-0)株作製を試み、神経系細胞の低酸素抵抗性獲得に関わる重要な新規遺伝子の同定を目指している。平成11年度はまず、ヒト胎児性癌由来Ntera-2、ヒト神経芽腫由来およびマウスシュワン細胞由来株細胞を用い、エチジウムブロミド(EBr)存在下に培養し、mtDNA欠失細胞(rho-0)株作製を試みた。Ntera-2細胞はEBrに対する感受性が高く、rho-0化細胞は得られなかった。残りの各株細胞からは1-2g/mlのEBr濃度に耐性なクローンを10種以上樹立できた。それらのmtDNAレベルは、PCRによる検討から、細胞あたり一個以下と推定された。02消費能は検出感度以下であり、LDH活性および乳酸産生能は代償性に亢進していた。電顕観察ではそのミトコンドリアは膨化し、ときに渦巻き状で、mtDNA欠失によって起こるヒトの進行性脳眼症(PEO)で見られる形態との類似性を示した。他方で、マイクロキャピラリーを用いて単一細胞を単離・回収し、単一細胞由来全cDNAを一方向性に効率良く増幅する系を今年度確立することができた。逆転写酵素の持つターミナルヌクレオチジルトランスフェラーゼ活性を利用して、cDNAの両端に異なる配列を導入した、単一細胞由来全cDNAを合成し、PCRにより増幅し、cDNAライブラリー作製・RLCS法の実施に十分な量の単一細胞由来全cDNAを得る系を組み立てた。低酸素耐性を獲得した細胞群は必ずしも一様な細胞集団ではないことから、耐性獲得に関わる遺伝子を効率よく単離・同定するためには、最終的には同一株由来の各細胞間や由来の異なる株間で遺伝子発現状態を比較する必要がある。今年度の研究を通じてその技術的基盤を得たと考える。

Research Products

(6 results)

All Other

All Publications (6 results)

[Publications] Shiga K,Fukuyama R,Kimura S,Nakajima K,Fushiki S.: "Mutation of the sterol 27-hydroxylase gene(CYP27)results in truncation of mRNA expressed in leucocytes in a Japanese family with cerebrotendinous xanthomatosis"J.Neurol.Neurosurg.Psychiatry. 67. 675-677 (1999)
[Publications] Yuh I,Yaoi T,Watanabe S,Okajima S,Hirasawa Y,Fushiki S.: "Up-regulated uridine kinase gene identified by RLCS in the ventral horn after crush injury to rat sciatic nerves"Biochem.Biophys.Res.Commun.. 266. 104-109 (1999)
[Publications] Morimoto S,Sasaki S,Itoh H,Nakata T,Takeda K,Nakagawa M,……Fushiki S.: "Sympathetic activation and contribution of genetic fators in hypertension with neurovascular compression of the rostral ventrolateral medulla"J.Hypertens.. 17. 1577-1582 (1999)
[Publications] Hirai K,Yoshioka H,Kihara M,.,Sakamoto T,Sawada T,Fushiki S.: "Inhibiting neuronal migration by blocking NMDA receptors in the embryonic rat cerebral cortex : a tissue culture study"Dev.Brain Res.. 114. 63-67 (1999)
[Publications] Hirai K,Yoshioka H,Kihara M,.,Sakamoto T,Sawada T,Fushiki S.: "Effects of ethanol on neuronal migration and neural cell adhesion molecules in the embryonic rat cerebral cortex : a tissue culture study"Dev.Brain Res.. 118. 205-210 (1999)
[Publications] Kanemura Y,Hiraga S,Arita N,……,Fushiki S,Yoshimine T.: "Isolation and expression analysis of a novel human homologue of the Drosophila glial cells missing(gcm)gene"FEBS Letters. 442. 151-156 (1999)

1999 Fiscal Year Annual Research Report

単一細胞RLCS法を用いた神経細胞虚血耐性関連遺伝子の探索

Principal Investigator

伏木 信次 京都府立医科大学, 医学部, 教授 (80150572)

Research Products

[Publications] Shiga K,Fukuyama R,Kimura S,Nakajima K,Fushiki S.: "Mutation of the sterol 27-hydroxylase gene(CYP27)results in truncation of mRNA expressed in leucocytes in a Japanese family with cerebrotendinous xanthomatosis"J.Neurol.Neurosurg.Psychiatry. 67. 675-677 (1999)

[Publications] Yuh I,Yaoi T,Watanabe S,Okajima S,Hirasawa Y,Fushiki S.: "Up-regulated uridine kinase gene identified by RLCS in the ventral horn after crush injury to rat sciatic nerves"Biochem.Biophys.Res.Commun.. 266. 104-109 (1999)

[Publications] Morimoto S,Sasaki S,Itoh H,Nakata T,Takeda K,Nakagawa M,……Fushiki S.: "Sympathetic activation and contribution of genetic fators in hypertension with neurovascular compression of the rostral ventrolateral medulla"J.Hypertens.. 17. 1577-1582 (1999)

[Publications] Hirai K,Yoshioka H,Kihara M,.,Sakamoto T,Sawada T,Fushiki S.: "Inhibiting neuronal migration by blocking NMDA receptors in the embryonic rat cerebral cortex : a tissue culture study"Dev.Brain Res.. 114. 63-67 (1999)

[Publications] Hirai K,Yoshioka H,Kihara M,.,Sakamoto T,Sawada T,Fushiki S.: "Effects of ethanol on neuronal migration and neural cell adhesion molecules in the embryonic rat cerebral cortex : a tissue culture study"Dev.Brain Res.. 118. 205-210 (1999)

[Publications] Kanemura Y,Hiraga S,Arita N,……,Fushiki S,Yoshimine T.: "Isolation and expression analysis of a novel human homologue of the Drosophila glial cells missing(gcm)gene"FEBS Letters. 442. 151-156 (1999)

伏木信次京都府立医科大学, 医学部, 教授 (80150572)