2000 Fiscal Year Annual Research Report
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11877327
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| Research Institution | Aichi Gakuin University |
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Principal Investigator |
早川 太郎 愛知学院大学, 歯学部・生化学講座, 教授 (80064822)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
山下 京子 愛知学院大学, 歯学部・生化学講座, 講師 (40231659)
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| Keywords | TIMP-1 / 有系分裂細胞 / クロモゾーム / 抗TIMPsモノクロナル抗体 / ウエスターンブロッティング / がん細胞 |
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| Research Abstract |
本年度の研究ではデメコリチンを用いる予定にしていたが、その後の検討でコルセミド(Demecolcin、和光純薬)の方が有効であることが明らかになったので、約70%コンフルエントのHeLa細胞の培地中にコルセミドを0.2μg/ml添加し、さらに16時間培養した。ピペッテッングにより分裂期の細胞をシャーレからはがした後、細胞を含む培地を900rpm、10分間遠心した。集めた細胞ペレットを10mlの75mM KCl低張液に懸濁し、氷中で30分間放置した(分裂期の細胞の占める割合は80%以上)、30分後750rpmで10分間遠心しKClを除き、つぎに5mlのポリアミン緩衝液〔15mMトリス-塩酸緩衝液(pH7.2)、2mM EDTA、0.5mM EGTA、80mM KCl、20mM NaCl、0.2mMスペルミン、0.5mMスペルミジン、14mM2-メルカプトエタノール〕に細胞を懸濁し、1500rpm、2分間遠心した。この洗浄操作を3回繰り返した。当初は、シヨ糖密度勾配法により精製する予定であったが、回収率が悪いため、0.1%ジギトニンを含むポリアミン緩衝液に細胞を懸濁し、Vortexミキサーを用い、最高スピードで約一分間撹拌することにより染色体を細胞外に放出させた。精製したクロモゾームの構成成分についてウエスタンブロッティングによりTIMPsタンパクを検索したところ、TIMP-1タンパクは確認できたが、それ以外のTIMP-2、-3および-4については確認できなかった。なお、TIMP-1に関してはクロモゾーム画分のスメアでも、抗TIMP-1抗体を用いた染色で確認できた。平成13年度には、SPBのような架橋形成試薬を用いてTIMP-1がどんなクロモゾーム構成成分と結合しているかを検索する予定である。
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