2000 Fiscal Year Annual Research Report
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11877412
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| Research Institution | Yamaguchi University |
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Principal Investigator |
乾 誠 山口大学, 医学部, 教授 (70223237)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
山田 康枝 山口大学, 医学部, 助手 (00166737)
木村 佳弘 山口大学, 医学部, 講師 (90301308)
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| Keywords | 強心薬 / Ca^<2+>ポンプ / ホスホランバン / 蛋白質間相互作用 / 組換え融合蛋白質 |
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| Research Abstract |
本研究は、心筋小胞体のカルシウム・ポンプ-ホスホランバン系に作用点を持った新たな強心薬開発のためのスクリーニング・システム確立を目指したものである。スクリーニングの原理は、カルシウム・ポンプのホスホランバン結合部位の融合蛋白質及び標識を付けたホスホランバンの部分ペプチドを使用して、両者の結合及び解離を指標とするものである。このようなスクリーニング・システムの確立のため、昨年度は、カルシウム・ポンプとホスホランバンとの結合を再現できるカルシウム・ポンプ融合蛋白質とホスホランバン部分ペプチド融合蛋白質の作成を行い、カラムを用いて両者の結合を再現し定量することに成功した。本年度は、薬剤スクリーニングのための大量サンプル処理法を確立するために、96穴プレートを用いた両融合蛋白質結合定量法の確立と本システム有効性の検討を行った。その結果、カルシウム・ポンプ融合蛋白質を96穴プレートに固相化し、ホスホランバン部分ペプチド融合蛋白質を加え、洗浄の後、ホスホランバン部分ペプチド融合蛋白質の標識に対する抗体で検出することにより、両融合蛋白質の結合量を定量することが出来た。この結合は、ホスホランバン部分ペプチド融合蛋白質のcAMP依存性燐酸化酵素により阻害された。同様の阻害は、cAMPによる燐酸化部位であるSer16をAspに置換した変異体ホスホランバン部分ペプチド融合蛋白質でも認められた。すなわち、本システムにおいてもカルシウム・ポンプとホスホランバンの結合が再現され、両者の結合の性質を保持していることが示された。さらに、今後見出そうとしている薬物と同様の効果を持つと考えられるホスホランバン抗体(mAbA1)の効果を調べたところ、濃度依存性に両蛋白質の結合を著明に阻害した。以上の結果は、本システムが薬剤スクリーニングにも有効であることを示している。
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Research Products
(4 results)
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[Publications] Yasue Yamada: "Modulation of the channel activity of ε2/ζ1 subtype NMDA receptor by PSD-95."Journal of Biological Chemistry. 274(10). 6647-6652 (1999)
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[Publications] Yasue Yamada: "Activation of channel activity of the NMDA receptor-PSD-95 complex by guany late kinase-associated protein (GKAP)."FEBS Letters. 458(3). 295-298 (1999)
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[Publications] Jing Zhai: "Cardiac-specific overexpression of a superinhibitory pentameric phospholamban mutant enhances inhibition of cardiac function in vivo."Journal of Biological Chemistry. 275(14). 10538-10544 (2000)
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[Publications] Elena Zvaritch: "The trnasgenic expression of high inhibitory monomeric forms of phospholamban in mouse heart impairs cardiac contractility."Journal of Biological Chemistry. 275(20). 14985-14991 (2000)
