2000 Fiscal Year Annual Research Report
高度好熱菌遺伝子操作のための薬剤耐性遺伝子の耐熱化
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11878118
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
倉光 成紀 大阪大学, 大学院・理学研究科, 教授 (60153368)
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| Keywords | 遺伝子操作 / 高度好熱菌 / Thermus thermophilus HB8 / 薬剤耐性遺伝子 / カナマイシンヌクレオチジルトランスフェラーゼ |
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| Research Abstract |
高度好熱菌Thermus thermophilus HB8は,遺伝子操作系が確立した生物の中で最も高温で棲息可能な生物である。この高度好熱菌とランダム変異法とを利用して,カナマイシンヌクレオチジルトランスフェラーゼ(Kan)をコードするカナマイシン薬剤耐性遺伝子を85℃まで耐熱化し,これまでで最も耐熱性の薬剤耐性遺伝子を作製することに作製に成功した。得られた耐熱性変異型酵素の中から約100個のクローンを選択して塩基配列を決定し,そらのアミノ酸配列を比較して,置換アミノ残基の中から耐熱化に寄与するいくつかのアミノ酸残基を同定した。耐熱化機構を調べるために,溶液中での蛋白質機能解析や分子動力学的計算を行ったところ,このKanの耐熱化は,分子の柔らかい部分を固くすることで達成されていることが示唆された。
この耐熱性遺伝子を利用して,高度好熱菌の遺伝子破壊株を作製する簡便な方法を確立,アミノ酸代謝系やDNA修復系酵素群の遺伝子破壊株を作製した。それによって得られた遺伝子破壊株は,期待通りのアミノ酸代謝欠損やDNA修復能欠損の性質を示した。
ここで確立した遺伝子破壊株作製法は,高度好熱菌T.thermophilus HB8の機能ゲノム科学的解析に威力を発揮し,得られた遺伝子破壊株の情報は,蛋白質の系統的立体構造解析(構造ゲノム科学的解析)の情報とともに,機能未知の蛋白質の機能解析に大いに役立つと期待される。
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[Publications] Nakai,T.: "Structure of Thermus thermophilus HB8 Aspartate Aminotransferase and Its Complex with Maleate"Biochemistry. 38(8). 2413-2424 (1999)
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[Publications] Hoseki,J.: "Directed Evolution of Thermostable Kanamycin-Resistant Gene Products in an Extremely Thermophilic Bacterium, Thermus thermophilus"J.Biochem.. 126(5). 951-956 (1999)
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[Publications] Yokoyama,S.: "Structural Genomics Projects in Japan"Nature Struct.Biol.. 7. 943-945 (2000)
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[Publications] Yokoyama,S.: "Structural Genomics Projects in Japan"Prog.Biophys.Molec.Biol.. 73. 363-376 (2000)
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[Publications] Ohnishi,T.: "Identification and Characterization of Thermus thermophilus HB8 RuvA Protein, the Subunit of the RuvAB Protein Complex that Promotes Branch Migration of Holliday Junctions"Genes Genet.Syst.. 75. 233-243 (2000)
