2012 Fiscal Year Annual Research Report
ヒトGPCR標的RNAアプタマーの創製とその応用による新規腫瘍診断薬の開発
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11J02416
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| Research Institution | Kobe University |
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Principal Investigator |
深尾 亜喜良 神戸大学, 大学院・工学研究科, 特別研究員(PD)
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| Keywords | RNAアプタマー / ソマトスタチン受容体 / SELEX / 腫瘍診断薬 |
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| Research Abstract |
本研究では内分泌腫瘍の診断および治療薬のリード化合物として、各SSTRサブユニットを標的としたSSTR作動性RNAアプタマーの創製を試みる。RNAアプタマーは、RNA結合部位を持たない細胞表面受容体に対しても創製可能であり、抗体を凌ぐ結合力と特異性を持つことが可能である。また塩基の化学修飾により安定化させることで、細胞表面で機能させることも可能である。
前年度の研究において期待されていたSSTR特異的に結合するRNAアプタマーを取得に至らなかった要因として、細胞の表面積におけるSSTRの割合が圧倒的に小さいために細胞表面に非特異的に結合するRNAアプタマーが多数を占めてしまい、SSTR特異的なRNAアプタマーが得られていないと考えた。本年度の研究では、その対応策として、GST融合SSTR組み換えタンパク質を用いたSELEXを第一スクリーニングとして実施した。しかしながら、解析の結果SSTR特異的RNAアプタマーの取得には至らなかった。この原因として、SELEXに使用している精製タンパク質の純度が挙げられる。大腸菌大量培養系を用いて精製したGST融合SSTRタンパク質でSELEXを実施したのだが、安定したSSTR全長タンパク質を精製するのは非常に難しく高純度のタンパク質を得ることはできなかった。そのために、さまざまな不純物に結合するRNAアプタマーが出現してしまったのではないかと考えられる。また、本来哺乳細胞の膜タンパク質として発現するSSTRは、大腸菌発現系では本来の形で発現させることができないという可能性も考えられる。これらの理由から、哺乳類培養細胞を用いた大量発現系を使ってSSTRタンパク質の過剰発現・精製を実施することが望ましいと判断した。そこで、本年度は哺乳類浮遊細胞培養系の立ち上げに着手し、過剰発現系を構築することに成功した。さらに、培養細胞から膜画分および細胞質画分を厳密に分離する手法も確立できた。そのため、今後はSSTRの細胞膜表面側に結合するだけのRNAアプタマーと作動性を有しSSTRを介して細胞内に取り込まれるRNAアプタマーを分離してSELEXを実施することが可能である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
大腸菌大量培養系を用いたGST融合SSTR組み換えタンパク質によるSELEXが困難であると判断し、SSTRを本来の形で発現させることが可能である哺乳類浮遊細胞培養系および過剰発現系を構築したこと、そして培養細胞から膜画分および細胞質画分を厳密に分離することに成功したことで、今後のSELEX実施において可能性を広げることができた。
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| Strategy for Future Research Activity |
SSTRにはSSTに対してほぼ同様の親和性を有するサブタイプが5つ存在する。そして現在のところ、SSTR2に対するRNAアプタマーのSELEXが中心になってはいるが、他のサブタイプについても発現細胞系列取得を目指し、順次作業は進行中である。SSTRの他のサブタイプについても同様の細胞系列を取得することは、RNAアプタマーを取得できた際、そのアプタマーがSSTR2特異的であるのか、他のサブタイプとも交差反応してしまうのかどうかを判断するのに必須であるため、次年度中には完成させておきたい課題である。
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