2011 Fiscal Year Annual Research Report
FRET-GT - 細胞内情報伝達分子の活性に基づくトランスクリプトミクス技術
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11J06044
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
幸長 弘子 京都大学, 生命科学研究科, 特別研究員(DC2)
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| Keywords | FRET / グリオブラストーマ / Racl / ライブイメージング / FACS / 浸潤 / 次世代シーケンサー / Rho-family GTPases |
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| Research Abstract |
(1)腫瘍細胞の情報伝達系の確率論的・動的なゆらぎの実証
Rac1,Cdc42,RhoA活性をモニターするFRETバイオセンサーを発現するグリオブラストーマ細胞をそれぞれ使用し、培養条件下で播種した細胞を顕微鏡下とセルサイトメーターにより集団として分子活性がどのくらい広がって分布しているのか検討した。その結果、どちらもRac1,Cdc42活性は幅広い分子活性分布を、RhoA活性は比較的狭い分子活性分布を示した。次にRac1活性の高い細胞と低い細胞をセルサイトメーターで分取して培養し、活性が元と同じ分布に回帰するかどうか検討した。1時間、1日後は活性が保たれているが、1週間後には元の分布に回帰した。よって、この活性の変化が動的・確率的に変化していること(ゆらぎ)が示唆された。また1細胞内でのRac1活性を5日間、タイムラプスFRETイメージングし活性がゆらいでいることを証明した。
(2)FRET-GT法を用いた腫瘍細胞におけるRac1分子活性の"ゆらぎ"の発生機構の解析
Rac1活性の高い細胞と低い細胞をセルソーターによって分取し、次世代シーケンサを使ってRNAの発現量を解析、(RNA-seq)した。同様に、Cdc42とRhoA活性の高い細胞群、低い細胞群もそれぞれRNA-seqを行った。その結果、活性の高い細胞群と低い細胞群を比較したとき発現変動の大きかった遺伝子は、Rac1とCdc42で似たような発現パターンを示した。一方、RhoA活性では似た発現パターンは確認できなかった。これらのことは、Rac1とCdc42の活性分布パターンが類似し、RhoAが異なることと一致している。さらに、遺伝子機能によって分類し統計処理したところ、Rac1活性の高い細胞群には細胞運動などRac1活性と関係する遺伝子が有意に存在することが分かった。
現在この中に含まれる遺伝子に注目し解析中である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
申請書に書いた通りの結果を得ることができ、進み具合も年次計画通りである。さらに、申請書にはRac1のみを書いたが、同じRho-family GTPasesのCdc42とRhoAについても解析を行えているので当初の計画以上に進展していると言える。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は、FRETによって分けられた細胞で特異的に発現上昇していた遺伝子に注目し、過剰発現、ノックダウンを行い、それらの遺伝子がRac1活性や浸潤能に与える影響を調べる。論文として発表する準備も始めている。
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