2011 Fiscal Year Annual Research Report
マツカワメラノコルチン受容体(MCR)のヘテロマー形成の可能性
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11J06342
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| Research Institution | Hiroshima University |
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Principal Investigator |
小林 勇喜 広島大学, 大学院・総合科学研究科, 特別研究員(PD)
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| Keywords | Xenopus tropicalis / メラニン凝集ホルモン / メラニン凝集ホルモン受容体 / Gタンパク質選択性 / マツカワ / 黒色素胞刺激ホルモン / メラノコルチン受容体 / ヘテロダイマー |
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| Research Abstract |
I.アフリカツメガエルを用いたMCHシステムの解明
アフリカツメガエル(Xenopus tropicalis)において4種のMCHR(MCHR1a,MCHR1b,MCHR2a,MCHR2b)サブタイプのcDNA構造を決定した。翻訳したアミノ酸配列をもとに、MCHRの進化系統樹を作成したところR1、R2共にサブタイプaは哺乳類MCHRに、bは魚類MCHRに近い可能性が示された。即ち、Xenopus tropicalisは哺乳類と魚類のそれぞれの特徴を持つMCHRサブタイプを有する可能性が考えられた。魚類MCHR1はGqと共役し、R2はGqおよびGi/oと共役する。一方、哺乳類R1はGqおよびGi/oと共役するが、R2はGqのみと共役する。以上のように、MCHRサブタイプは哺乳類と魚類でGタンパク質選択性が異なる。そこで、各MCHR発現ベクターを構築後、培養細胞発現系(CHO細胞)を用いて受容体機能解析を行った。その結果、Xenopus tropicalis MCHR1のGタンパク質選択性が、1a(GqおよびGi/o)は哺乳類に、1b(Gq)は魚類に近いことを支持する結果を得た。また、RT-PCR法により発現組織の分布を調べたところ、摂食中枢が存在する脳では4種類のMCHRが発現しており、体色調節機能に関与する皮膚では1bの発現を認めた。
H.マツカワMCRヘテロマー形成の可能性
震災により、マツカワMCR挿入ベクターが消失したため、再度クローニング後、MC1RとMC5Rの発現ベクターを構築した。MCRは細胞内でGsと共役しcAMP濃度を上昇させる。そこで、HEK293T細胞にMC1RあるいはMC5R発現ベクターを一過性に導入し、α-MSH(アセチル基有り)とDes-Ac-α-MSH(アセチル基無し)を用いて刺激後cAMP量を測定した。その結果、MC1R、5R共にα-MSHの方が親和性が高く、MSH類は共にMC1Rのほうが5Rよりも親和性が高いことが示された。以上の結果は、マツカワ皮膚の培養実験から得られた「MCRが単独で発現する際にはアセチル基によりMSHの活性が増強される」という現象を支持するものである。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
1年目に予定していたアフリカツメガエルの研究は、MCHR2aと2bの機能解析を除いて、概ね達成した。また、1年目に予定していなかったマツカワを用いた研究も精力的に行い、MC1RとMC5Rの発現ベクターを構築すると共に、各MCRに対するMSH類の親和性を明らかにした。以上より、順調に進展しており2年目の研究内容に円滑に移行可能である。
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| Strategy for Future Research Activity |
I.アフリカツメガエルを用いたMCHシステムの解明
MCHR2aと2bの機能解析を行う。細胞内Ca^<2+>濃度の測定を中心に行う予定だが、シグナルの検出が困難な場合は、ERKリン酸化等の他のシグナル経路を介する可能性も考慮して研究を行う。また、Xenopus tropicalisを安定して飼育する環境を整えた。以上より、飼育実験および皮膚の培養実験等も遂行可能である。
II.マツカワMCRヘテロマー形成の可能性
N末端にタグ(Flag,HA)を付加したMCR発現ベクターを構築する。その後HEK293T細胞にMC1Rと5Rを共導入し、両者の共局在の確認、および各免疫沈降法による生化学的確認を行う。また、cAMPアッセイやレポーターアッセイにより各種リガンドのEC50値やその最大反応が如何に変動するかを解析する。また、HEK293T細胞でヘテロマー形成が認められなかった場合には、CHO細胞等の他の細胞も用いることも念頭に入れる。
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Research Products
(6 results)
