2011 Fiscal Year Annual Research Report
ニンジン培養細胞におけるストレス応答性遺伝子DcMYB1の発現制御機構の解析
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11J07669
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| Research Institution | Tokyo University of Agriculture and Technology |
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Principal Investigator |
宮原 平 国立大学法人東京農工大学, 大学院・工学府, 特別研究員(DC2)
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| Keywords | アントシアニン / アシルグルコース依存型アントシアニン配糖化酵素 |
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| Research Abstract |
ニンジン培養細胞におけるストレス応答性遺伝子DcMYB1の発現を抑制していることが示唆された転写抑制因子DcEILのDcMYB1プロモーター上の結合認識配列の探索を行った。この研究により植物ホルモンによる二次代謝系の制御の新たな知見が得られることが考えられる。ゲルシフトアッセイにより認識配列の検討を行った。しかしながら、ポジティブコントロールであるDcMYB1プロモーターの全抑制領域へのDcEILの結合が検出されず、検出感度の問題またはDcEILの安定性の低さが考えられた。さらにエチレンシグナル応答にDcEILが関与していることを確認するため相補体作成のためのノックアウト(ein3)体植物体の育成中。このため実験期間が空いてしまうことから予備実験として進めていたシロイヌナズナおよびアガパンサスにおけるアシルグルコース依存型アントシアニン配糖化酵素の解析の研究を行った。2010年に当研究室からカーネーションおよびデルフィニウムよりアシルグルコースを糖受容体とし、アントシアニンを糖供与体とする新規の糖転移反応が検出され、その酵素遺伝子が単離された(Matsuba et al,2010)。この酵素はアシルグルコース依存型アントシアニン配糖化酵素(Acyl-glucose-dependent anthocyanin glucosyltransferase: AAGT)と命名された(Matsuba et al,2010)。シロイヌナズナのアントシアニン修飾酵素同士の共発現解析またシロイヌナズナ植物体の各部位およびアントシアニン誘導時とストレス時における候補遺伝子の発現量をreal-time RT-PCRにより測定し、AAGT候補遺伝子をAtBGLU1,7,9まで選別した(Miyahara et al,2011)。これまでのAAGTの発見は双子葉類に限れられていたが、単子葉類であるアガアパンサスにおいてもその主要アントシアニンの構造よりAAGT様酵素遺伝子の存在が考えられた。そのため、花弁粗酵素抽出液を用いAAGT反応の検出を試みたところCyanidin 3-glucosideの7位にアシルグルコースを糖供与体として糖転移反応を触媒することが示された。ディジェネレートPCRの結果、AAGT cDNAを単離し、AAGT酵素の生化学的解析を行った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
DcEILのDcMYB1プロモーター上の結合認識配列の探索を行い、DcEIL結合認識配列を特定する予定でいたが、ゲルシフトアッセイによる試験の結果、ポジティブコントロールであるはずの抑制領域全域に対するDcEILの結合が検出できなかったため、認識配列の絞り込みを行えていない。Yeast one-hybrid法による結果では抑制領域中に2箇所以上の認識部位があることが示唆されたが明確な結果は得られなかった。シロイヌナズナein3/35S-DcEIL相補体の作成は予定通り進んでいる。
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| Strategy for Future Research Activity |
DcEILのDcMYB1プロモーター上の認識配列の特定が行えておらず、ゲルシフトアッセイの検出試薬の変更またはDcEILタンパク質の大量精製の必要が考えられた。またウスタンブロッティング法によるDcEIL抗体作成において特異的にDcEILを検出できる抗体の作成が必須であり、現時点で行えていない。この二点の実験を遂行できない場合、生体内でのDcEILの挙動を調査できず、ストレス処理時および阻害剤処理時のタンパク質レベルでのDcEILの解析ができないため新たなデータを得ることができないことが考えられる。一方で予備実験として行っているアシルグルコース依存型アントシアニン配糖化酵素の研究ではある程度の成果をあげることができており、こちらの実験を集中して行っていくことを考えている。
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Research Products
(4 results)
