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2012 Fiscal Year Annual Research Report

非平衡キャピラリー電気泳動法を用いた新規人工核酸アプタマーの創製

Research Project

Project/Area Number 11J10396
Research InstitutionGunma University

Principal Investigator

笠原 勇矢  群馬大学, 大学院・工学研究科, 特別研究員(DC1)

Keywords核酸アプタマー / ランダムスクリーニング / キャピラリー電気泳動 / 架橋型核酸 / スイッチ分子 / 分子認識
Research Abstract

種々の標的分子に対応できる一般性の高い人工核酸アプタマーのスクリーニング・システムの構築を目指して、CE-SELEXによるトロンビンを標的分子としたアプタマーの創出を、種々のライブラリを用いて行った。これまで、ヌクレアーゼ耐性が非常に高い核酸アナログである架橋型核酸(2',4'-BNA/LNA)を含む人工核酸アプタマーの創出は困難とされてきたが、CE-SELEX法を基盤とした独自のセレクション系の構築により、2',4'-BNA/LNAアプタマーの創出に成功した。また、2',4'-BNA/LNAプライマーに対し、N6-アミノエチルアデニンを導入した塩基部修飾チミジンや2'-フルオロデオキシグアノシンを組み合わせた人工核酸ライブラリから、トロンビンに対するキメラ型人工核酸アプタマーの創出にも成功した。
塩基修飾を含むキメラ型人工核酸アプタマーについて配列解析を行ったところ、グアニン四重鎖モチーフの出現頻度が著しく抑制され、修飾チミジンを多く含む配列モチーフの出現がみられた。それらの多くはサブナノモラーという非常に高い結合親和性を示した。さらに、結合活性に対する架橋型ヌクレオチドの効果について非平衡キャピラリー電気泳動法(NECEEM)で検証したところ、Apt#D1および#D6では、架橋型ヌクレオチドを天然型のデオキシリボヌクレオチドに置換することで完全に結合活性が失われることが分かった。架橋型ヌクレオチドは、架橋構造の改変によって外部刺激に応じて架橋部位を開/閉環できるため、環境応答性人工核酸スイッチ分子の創製が期待される。
高親和性アプタマー(Apt#D6)の結合特異性について、リゾチーム、大豆レクチン、ストレプトアビジンおよびラットトロンビンを用いて検証したところ、ラットトロンビンに対しては標的のヒトトロンビンと同等の親和性を示したものの、他の3種に対しては結合しなかった。このように、得られた人工核酸アプタマーは、高い親和性と特異性および結合活性がプライマー部分の架橋構造に大きく依存するユニークな特性を有することを明らかにした。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

当初の目標のとおり、2',4'-BNA/LNAを含む種々のライブラリから標的分子に対する人工核酸アプタマーを創出することができた。また、修飾基の効果や特異性、生体内安定性などを精査することにより、創出した人工核酸アプタマーの特性について評価することもできた。これらの結果は、ライブラリ設計の指針となることが期待できる。

Strategy for Future Research Activity

システムの効率化によるコスト低減や迅速化を図るために、ライブラリのさらなる最適化を行う。その上で、種々の人工核酸ライブラリを用いたスクリーニングを行い、標的分子とライブラリの組み合わせによるHit率の相関などについて考察する。さらに、特異性、ヌクレアーゼ耐性や血清中における安定性に関する測定結果も踏まえ、治療薬として高い有効性が見込まれる人工核酸アプタマーを取得する。
さらに、共同研究先に赴いてそれらのin vivo評価を行う予定である。

  • Research Products

    (6 results)

All 2013 2012

All Journal Article (3 results) (of which Peer Reviewed: 3 results) Presentation (3 results)

  • [Journal Article] 2',4'-BNA/LNA aptamers : CE-SELEX using a DNA-based library of full-length 2'-O, 4'-C-methylene-bridged/linked bicyclic ribonucleotides2013

    • Author(s)
      Yuuya Kasahara, et al.
    • Journal Title

      Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters

      Volume: 23 Pages: 1288-1292

    • DOI

      10.1016/j.bmcl.2012.12.093

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] CE-SELEX Selection of Base and Sugar-modified DNA Aptamers : Target Binding Dominated by 2', 4'-BNA/LNA Primer2013

    • Author(s)
      Yuuya Kasahara, et al.
    • Journal Title

      Analytical Chemistry

      Volume: (in press)

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Artificial specific binders directly recovered from chemically modified nucleic Acid libraries2012

    • Author(s)
      Yuuya Kasahara and Masayasu Kuwahara
    • Journal Title

      Journal of Nucleic Acids

      Volume: 2012 Pages: 156482

    • DOI

      10.1155/2012/156482

    • Peer Reviewed
  • [Presentation] プロト型キセノ核酸スイッチ分子の創製2013

    • Author(s)
      笠原勇矢, ら
    • Organizer
      日本化学会第93回春季年会
    • Place of Presentation
      立命館大学びわこ・くさつキャンパス(滋賀)
    • Year and Date
      2013-03-23
  • [Presentation] CE-SELEXによる非グアニン四重鎖型高親和性人工核酸アプタマーの創製2012

    • Author(s)
      笠原勇矢, ら
    • Organizer
      第6回バイオ関連化学合同シンポジウム2012
    • Place of Presentation
      北海道大学高等教育推進機構(北海道)
    • Year and Date
      2012-09-06
  • [Presentation] High-affinity DNA Aptamers with Base and Sugar-modifications Readily Obtained by CE-SELEX2012

    • Author(s)
      Yuuya Kasahara, et al.
    • Organizer
      The Second Asian Chemical Biology Conference 2012
    • Place of Presentation
      サザンビーチホテル&リゾート沖縄(沖縄)
    • Year and Date
      2012-07-05

URL: 

Published: 2014-07-16  

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