循環調節ホルモンをリガンドとするGPCRの構造的理解と機能性抗体の合理的な創出

2013 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 11J40150
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 万木 貴美 京都大学, 医学研究科, 特別研究員(RPD)
• Keywords: 循環調節ホルモン / GPCR / リガンド / 結晶構造解析 / 機能性抗体

Research Abstract

メタボリックシンドロームでは、肥満とインスリン抵抗性を背景とする多くの代謝異常が重責し、心筋梗塞や脳血管障害、腎血管障害等が発症する。これらの血管合併症の発症および進展には、多彩な生理活性を有する循環・代謝調節ホルモンによる恒常性バランスの破綻が関与している。循環調節ホルモンの多くはG蛋白質共役受容体(Gprotein-coupled receptor : GPCR)を介して作用することが知られている。循環調節ホルモンの一つであるアドレノメデュリンは、強力な血管拡張作用による降圧物質として発見されたが、その後抗酸化作用、腎保護作用等の臓器保護作用も有することが明らかとなった。また、アドレノメデュリン欠損マウスは、血圧の上昇に加えて、動脈硬化や加齢に伴う肥満、耐糖能異常等が認められる。これらの結果はアドレノメデュリンがメタボリックシンドローム発症の分子基盤となっている可能性を示唆しており、その機能的・構造的理解は血管合併症の新規治療法に重要であると考えられる。血管合併症の治療には、これらの内分泌ホルモンおよびその関連因子の分子機構を理解し、メタボリックシンドロームの発症予防を含めた治療展開が必要となる。しかし、メタボリックシンドローム自体が多因子疾患であるため、いまだ不明な点が多い。そこで、万木らは循環調節ホルモンをリガンドとするGPCRのX線結晶構造解析により、血管合併症の包括的な理解と新規治療法の開発を目指している。万木らの開発したGPCRの大量生産技術を用いてそれに対する構造認識抗体を創出し、この抗体フラグメントと循環調節ホルモンをリガンドとするGPCRの複合体の結晶構造解析を行う。同時に、これらのGPCRの機能アッセイを組み合わせることにより、ターゲットGPCRの機能を選択的に制御する機能性抗体の作製を行い血管合併症の新規治 療法開発に繋げたい。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

循環調節ホルモとをリガンドとするヒト・アンギオテンシン受容体AT2サブタイプを発現、精製し、脂質二重膜中に再構築したプロテオリポソームを免疫することで、立体構造認識抗体を作製した。平成25年度は、昨年度に引き続きアンギオテンシン受容体AT2サブタイプ/抗体複合体の蒸気拡散法および脂質キュービックフェーズ法による結晶化条件のスクリーニングと結晶化条件の最適化をこころみたが、まだ分解能は上がってきていない。

Strategy for Future Research Activity

ヒト・グレリン受容体GHSRについて高発現株のスクリーニングを行った。その中で比較的安定な変異体を選び、昆虫細胞を用いて大量発現・精製を試みた。グレリン受容体は精製することができたものの、高濃度では凝集しやすく、熱安定性を調べてみたものの、結晶化に耐えられる程度の熱安定性を保持していないことが明らかとなった。平成25年度は、グレリンを発見した久留米大学の児島将康教授と共同研究しており、コムギ無細胞系で発現させたグレリン受容体がリガンド結合能を非常に高く保持していることを明らかとした。今後は、このサンプルを抗原としてグレリン受容体欠損マウスに免疫し、立体構造を認識するモノクローナル抗体を取得したいと考えている。