2000 Fiscal Year Annual Research Report

RNAをターゲティングする蛋白質の検索システムのデザイン

Research Project

Project/Area Number	12019208
Research Institution	The University of Tokyo
Principal Investigator	上田卓也東京大学, 大学院・新領域創成科学研究科, 教授 (80184927)
Keywords	分子進化系 / 蛋白質合成系 / リボソーム蛋白質 / 翻訳制御
Research Abstract	遺伝情報発現の転写レベルでの制御の全容が、真核生物を中心として明らかになりつつあるが、翻訳レベルでの制御機構に関しては、その解明はいまだ十分とは言い難い。翻訳段階での制御は、転写とは異なり、短時間かつデリケートに行えるために、利点が多いと考えられ,今後多様な制御機構が明らかにされるものと予想される。本研究では、RNAに結合能を持つ蛋白質を、スクリーニングするシステムを構築することにより、翻訳レベルでの制御機構の全体像に迫ることに挑戦する。すでに大腸菌の精製した必須な成分から再構築した無細胞翻訳系(PURE SYSTEM)の開発に成功している。このPURE SYSTEMには、蛋白質やRNAなどを分解する成分が含まれないことから、今後ポリソームディスプレー法の主流となるものと期待されている。本研究ではPUREシステムを翻訳制御の研究における中心的なスクリーニングの系として確立することを目的とする。まず,PURE SYSTEMにより、cDNAのラブラリーから、蛋白質を合成させ、新生ペプチドの中から、mRNAに結合能を持つものを選抜する。あらかじめcDNAには、タグ配列を挿入しておき、このタグを利用して、ペプチドと結合したmRNAを選抜し、RT-PCR、PCRにより増幅する。このサイクルを繰り返すことで、自らのmRNAに結合する蛋白質の遺伝子のみが濃縮されていく。このことにより特異的なRNA-蛋白質相互作用をとらえることが可能となると期待される。自らのmRNAに結合することがすでに知られている大腸菌リボソーム蛋白質S15を用いて、本システムの有効性を検討した。S15のmRNAの5'に存在するS15結合部位であるシュウドノット構造を形成できない変異型と、天然型の遺伝子をT7-tagと融合したものを作製した。この両者のmRNAを共存させたサンプルをPUREシステムで翻訳させ、合成された蛋白質に結合するmRNAをT7抗体により回収した。その結果、変異型に比べて天然型のRNAが優先的に選抜されていることが示された。現在この濃縮効率の向上を検討しているが、本システムが自らmRNAの結合するペプチドを選抜するのに有効なことが示された。

Research Products

(5 results)

All Other

All Publications (5 results)

[Publications] Yasukawa,T: ""A pathogenic point mutation reduces stability of mitochondrial mutant tRNA^<lle>""Nucleic Acids Research. 28. 3779-3784 (2000)
[Publications] Tomari,Y: ""The role of tightly bound ATP In Escherichia coli tRNA nucleotidyltransferase""Genes to Cells. 5. 689-698 (2000)
[Publications] Yokogawa,T: ""Characterization and tRNA Recognition of Mammalian Mitochondrial Seryl-tRNA Synthetase""J.Biol.Chem.. 275. 19913-19920 (2000)
[Publications] Tasukawa,T: ""Defect in modification at the anticodon wobble nucleotide of mitochondrial tRNA^<Lys> with the MERRF encephalomyopathy pathogenic mutation""FEBS Letters. 467. 175-178 (2000)
[Publications] Yasukawa,T: ""Modification Defect at Anticodon Wobble Nucleotide of Mitochondrial tRNAs^<Leu>(UUR) with Pathogenic Mutation of Mitochondrial Myopathy, Encephalopahty, Lactic Acidosis, and Stroke-like Episodes""J.Biol.Chem.. 275. 4251-4257 (2000)

2000 Fiscal Year Annual Research Report

RNAをターゲティングする蛋白質の検索システムのデザイン

Principal Investigator

上田 卓也 東京大学, 大学院・新領域創成科学研究科, 教授 (80184927)

Research Products

[Publications] Yasukawa,T: ""A pathogenic point mutation reduces stability of mitochondrial mutant tRNA^<lle>""Nucleic Acids Research. 28. 3779-3784 (2000)

[Publications] Tomari,Y: ""The role of tightly bound ATP In Escherichia coli tRNA nucleotidyltransferase""Genes to Cells. 5. 689-698 (2000)

[Publications] Yokogawa,T: ""Characterization and tRNA Recognition of Mammalian Mitochondrial Seryl-tRNA Synthetase""J.Biol.Chem.. 275. 19913-19920 (2000)

[Publications] Tasukawa,T: ""Defect in modification at the anticodon wobble nucleotide of mitochondrial tRNA^<Lys> with the MERRF encephalomyopathy pathogenic mutation""FEBS Letters. 467. 175-178 (2000)

[Publications] Yasukawa,T: ""Modification Defect at Anticodon Wobble Nucleotide of Mitochondrial tRNAs^<Leu>(UUR) with Pathogenic Mutation of Mitochondrial Myopathy, Encephalopahty, Lactic Acidosis, and Stroke-like Episodes""J.Biol.Chem.. 275. 4251-4257 (2000)

上田卓也東京大学, 大学院・新領域創成科学研究科, 教授 (80184927)