ゲノムにおけるナチル化パターン解析方法に関する研究

2000 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 12024225
• Research Institution: Soka University
• Principal Investigator: 前田 英勝 創価大学, 工学部, 教授 (30277876)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 酒井 強 創価大学, 工学部, 助手 (70308279)
• Keywords: ゲノム / ナチルシトシン / ナチル化パターン / シトシン デアミナーゼ / シチジンデアミナーゼ / 耐熱性

Research Abstract

ゲノムにおけるメチル化パターンを解析するために広い基質特異性および耐熱性を有するシトシンデアミナーゼ(CDA)およびデオキシシチヂンデアミナーゼ(dCDA)が必要であり、これらの探索を試みた。耐熱性酵素を必要とする理由は2本鎖DNAの脱アミノ化を行う場合DNAを一本鎖にする必要があり、そのためには温度を90℃以上に上げ、脱アミノ化反応を行なわなければならないためである。
初めに、CMP、dCMPおよびシトシンを基質として用い、これらの資化性微生物を土壌中から分離した。これらの菌体中からCDAおよびdCDAを精製し、ついで、DNAテトラマー、すなわち、dC-dC-MedC-dCに対して脱アミノ化を試みた。その結果、CDAおよびdCDAともにテトラマーに対して脱アミノ化活性が微弱ながら認められたが、再現性に難点があり、現在、さらに検討を続行している。
シトシン資化性菌の中でCDAの他に耐熱性のdCDAを有する1菌株を見いだした。このdCDAは100℃で1時間処理しても活性を有していた。ただし、120℃でのオートクレーブではその活性を失った。酵素の精製は以下のように行った。菌体破砕液を硫安塩析した後DEAE-トヨパールに吸着させ、0.1-0.2M NaClで溶出させ、これをpH5.0で100℃、2分間処理した。この処理でも初めの活性の75%が残存していた。この熱処理画分をSDS-PAGEで解析したところ分子量2万前後の位置にバンドがあり、その他に分子量1万以下にスメアのバンドが認められた。このdCDAにはCDA活性は認められなかった。
30℃でのdCDAの比活性はこの時点で0.16IU/mg.今後、さらに詳細な検討を続ける予定である。