2000 Fiscal Year Annual Research Report
RPA1による-786C変異型eNOS遺伝子転写抑制機構の解明
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12032209
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
斎藤 能彦 京都大学, 医学研究科, 助教授 (30250260)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
吉村 道博 熊本大学, 医学部・附属病院, 講師 (30264295)
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| Keywords | eNOS遺伝子 / 遺伝子多型 / サプレッサー / 冠攣縮性狭心症 / RPA1 / NOx |
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| Research Abstract |
我々は、熊本大学循環器内科との共同研究で冠攣縮性狭心症の病因にeNOS遺伝子異常が深く関与していることを報告してきた。冠攣縮性狭心症と強い関連を示す(Odds ratio 5.7)eNOS遺伝子5'転写調節領域のT-786C変異の機能解析を行った結果、変異型遺伝子にサプレッサーが結合し、eNOS転写活性を低下させている実験結果を得た(Circulation 1999)。更にこのT-786C変異に結合する蛋白質を精製した結果、目的の蛋白質は、ヒトではDNA修復に与るreplication protein A1(RPA1)と同一蛋白質であった(Human Molecular Genetics2000)。T-786C変異がeNOS遺伝子発現低下に関係していることを、in vitro in vivoの双方で検討し、以下の実績を得た。
1.T-786C変異配列のサプレッサーエレメントとしてのin vitroでの証明
eNOS遺伝子5′転写調節領域1.6kbpをルシフェラーゼリポーター遺伝子に結合し、T-786C変異部位を中心に11bp欠失させたところ、ルシフェラーゼ活性は野生型のレベルまで回復した。またSV40の5′基本転写調節領域を結合させたリポーター遺伝子に、T-786C変異部位を中心にした20bpのオリゴヌクレオチドを3つタンデムに結合させるとそのリポーター活性は低下した。これらのことからT-786C変異配列がサプレッサー配列であることがわかった。また、RPA1の翻訳開始点を含む領域のアンチセンスオリゴヌクレオチドをHUVECにトランスフェクションするとeNOS遺伝子の転写活性を抑制した。
2.T-786C変異配列のサプレッサーエレメントとしてのin vivoでの証明
-786C変異型胎盤と野生型胎盤を用いてeNOS遺伝子発現とRPA1の蛋白発現を検討すると、両遺伝子型にてRPA1の発現量には差がなかったが、eNOSmRNA発現は変異型胎盤にて有意に低下していた。また、血中NOx濃度を両遺伝子型で検討すると変異型の症例の方が血中NOx濃度が有意に低下していた。
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[Publications] K. Kuwahara: "Neuron-Restrictive Silencer Element/Neuron-Restrictive Silencer Factor System Regulates Basal-and Endothelin-1-Inducible Atrial Natriuretic Peptide Gene Expression in Ventricular Myocytes"Mol Cell Biol.. 21. 2085-2097 (2001)
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[Publications] Y.Mizuno: "Aldosterone Production is Activated in the Failing Ventricles in Humans."Circulation.. 103. 72-77 (2001)
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[Publications] I.Hamanaka: "Induction of JAB/SOCS-1/SSI-1 and CIS3/SOCS-3/SSI-3 Is Involved in gp130 Resistance in Cardiovascular System in Rat Treated with Cardiotrophin-l (CT-l) in vivo."Circ. Res.. (In Press). (2001)
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[Publications] K.Kuwahara: "Cardiotorphin-l phosphorylates Akt and BAD, and prolongs cell survival via a PI3K-dependent pathway in cardiac myocytes."J.Mol.Cell.Cardiol.. 32. 1385-1394 (2000)
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[Publications] E.Ogawa: "Outside-in Signaling of Fibronectin Stimulates Cardiomyocyte Hypertrophy in Cultured Neonatal Rat Ventricular Myocytes"J.Mol.Cell Cardiol.. 32. 765-776 (2000)
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[Publications] S.Asai: "The Heart Is a Source of Circulating Cardiotrophin-l in Humans"Biochem.Biophys.Res.Commun.. 279. 320-323 (2000)
