蛋白性蛍光センサープローブによるショウジョウバエ脳の情報処理経路の研究

2001 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 12048227
• Research Institution: Okazaki National Research Institutes
• Principal Investigator: 中井 淳一 岡崎国立共同研究機構, 生理学研究所, 助手 (80237198)
• Keywords: GFP / ショウジョウバエ / カルシウム / バイオセンサー

Research Abstract

本研究はGreen Fluorescent Protein(GFP)を用いてカルシウムイオンを持つプローブを開発し、ショウジョウバエの脳に発現させて臭覚系および味覚系の神経回路の同定とその情報処理の過程を明らかにすることを目標とする。
GFPにカルモジュリンとそれに結合するミオシン軽鎖キナーゼのM13配列をfusionさせることによりカルシウムイオンに対する蛋白性蛍光プローブの作成を行った。このプローブは1波長励起(489nm)1波長測光(509nm)のプローブであり、その蛍光変化量が最大で4.5と大きいため、この遺伝子を筋肉細胞に発現させたとき顕微鏡を通して肉眼的にもその蛍光の変化を観察できるほどであった。このプローブに関して特許を申請した。
G-CaMPには温度感受性があるため、培養細胞に発現させ37度で培養したとき蛍光団を形成できないという問題があった。この点を改良するために蛋白質のfoldingを安定化することが知られている点突然変異をG-CaMPに導入して新たにG-CaMP1.6を作成した。G-CaMP1.6は残念ながら37度では蛍光団を形成できなかったが、28度で蛍光団を形成しモル吸光係数、量子収率ともにG-CaMPより大きな値を示した。その結果G-CaMP1.6はG-CaMPに比較して約40倍明るいことが明らかとなった。またG-CaMP1.6は蛍光団を形成する速さが速く、その時定数は約22分で、G-CaMPの時定数に比べて約3倍速くなっていた。G-CaMP1.6のKdは146nM,Hill係数は3.8,最大蛍光変化量は4.9であった。現在G-CaMPおよびG-CaMP1.6をショウジョウバエ等の動物に発現させin vivoでの測定を行いつつある。

Research Products

• [Publications] Proenza C, O'Brien J, Nakai J, Mukherjee S, Allen PD, Beam KG.: "Identification of a region of RyR1 that participates in allosteric coupling with the alpha(1S)(Ca(V)1.1)II・III loop"J. Biol. Chem.. 277. 6530-6535 (2002)