生体ストレスによる脳神経組織障害の発生メカニズムの解析--p53を介して誘導される脳神経系細胞死に関連するシグナル分子の検索--

2000 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 12050233
• Research Institution: Kumamoto University
• Principal Investigator: 荒木 令江 熊本大学, 医学部, 助手 (80253722)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 佐谷 秀行 熊本大学, 医学部, 教授 (80264282)
• Keywords: プロテオミクス / p53 / ノックアウトマウス / NF1 / NF2 / NE-dlg / 遺伝子疾患モデルマウス / 神経細胞

Research Abstract

我々は、慢性的な虚血やてんかん性発作等における局所的な脳組織細胞変性の発生に、p53分子を介する脳神経特異的な細胞死へのシグナルが大きく関与していることを明らかにした。この現象のメカニズムを解明するため、脳神経細胞内で特異的にp53の発現を調節する分子、或いはp53に関連してシグナルを伝達する全ての分子の同定が重要であると考えられた。独自に開発した蛋白質レベルのdifferencial display法と、マウス脳cDNAアレイを用い、ストレス負荷有無における、p53正常(p53+/+)、及びノックアウトマウス(p53-/-)の脳神経組織・細胞におけるp53の動態解析と、p53の動態に付随して変化する全分子の検索・同定、及び機能解析を検討している。本年度はストレス非付加状態での脳組織・細胞画分より微量蛋白質の解析法(二次元電気泳動・画像解析,HPLC,微量N-,C-末端,内部アミノ酸シークエンス,マススペクトル,EST data baseによるcDNAクローニング)を確立し、種々の脳神経系機能性遺伝子産物の動態解析、及び細胞内関連分子の同定に応用した。又p53に加えて,神経系調節因子NF1,NF2,NE-dlg遺伝子にも注目し、これらに関連して動態を変化させる蛋白質を脳組織可溶化物より検索・同定し、生化学/細胞生物学的解析を試みた。マウス脳組織(大脳皮質,小脳,海馬,線条体,脊髄,臭球)可溶化蛋白質の2次元電気泳動によるプロテオームマップを作成し、p53-/-脳組織と比較したところ、各組織のスポット約1000個中平均7個のp53-/-特異的変動蛋白質(apoptosis、腫瘍マーカー関連分子等を含む)が検出された。一方、細胞膜直下及び細胞質に存在し、直接的に細胞外からのシグナルの伝達に関わると考えられるNF1,NF2,NE-dlg遺伝子産物に関して、それぞれに対する細胞内特異的変動(結合)蛋白質群を解析した結果、NF1には8個の(constitutive NOS/NOの制御分子DDAH含む)、NF2には5個の(DNA修復,apoptosis,cell cycleに関わるPARP及びDNA-PKs(Ku85,ku70))結合蛋白が同定された。NE-dlgにはNMDA receptor 2B親和性制御因子新規蛋白質であるnedasinを同定した。これら個々の細胞内相互作用・機能制御に関して現在詳細な検討を加えるとともに、ストレス付加時のP53-/-マウスの脳蛋白質の解析を行っている。

Research Products

• [Publications] Araki,N., et.al.: "Comparative analysis of brain proteins from p53 deficient mice by two-dimensional electrophoresis."Electrophoresis.. 21,(9). 1880-1889 (2000)
• [Publications] Araki,N., et.al.: "Proteomic analysis of tumor suppressor related proteins in brain."Protein Science. 9,(1). 162 (2000)
• [Publications] Abiko A, et.al.: "Increased levels of advanced glycosylation end products in the kidney and liver from spontaneously diabetic Chinese hamsters determined by immunochemical assay."Metabolism.. 49(5). 567-573 (2000)
• [Publications] Tokuo,H. et.al.: "Phosphorylation of neurofibromin by cAMP dependent protein kinase is regulated via a cellular association of NG, NG-dimethylarginine dimethylaminohydrolase."FEBS Letters. (in press). (2001)
• [Publications] 荒木令江: "癌とプロテオーム"遺伝子医学. 4,(4). 605-611 (2000)
• [Publications] Araki,N., et.al.: "New Development in Glycomedicine, Study of autoantibody against advanced glycation endproducts of the Maillard reaction."Elsevier Science B.V (in press). (2001)
• [Publications] Araki,N., et.al.: "BIOJAPAN 2000, New Movement of Science "Proteomics" Functional proteomic analysis of tumor suppressor related proteins in brain."Japan Bioindustry Association (JBA), Japan Health Sciences Fundation (JHSF), Society for Technoinnovation of Agriculture, Forestry and Fisheries (STAFF), Japan Association of Bioindustries Executives (JABEX). 147-157 (2000)