種子貯蔵タンパク質遺伝子の制御情報統合化メカニズムの解析

2000 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 12138204
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (B)
• Research Institution: Mie University
• Principal Investigator: 服部 束穂 三重大学, 遺伝子実験施設, 助教授 (10164865)
• Keywords: ABA / 貯蔵タンパク質 / シグナル伝達 / リン酸化 / TRAB1 / イネ / 免疫沈降 / GFP

Research Abstract

[1]VP1/ABI3およびFUS3異所過剩発現トランスジェニック植物およびトランスジェニックカルスを用いた解析
イネFUS3ホモログOsFUS3cDNAをクローニングし、ActinプロモーターとOsFUS3cDNAの融合遺伝子を導入したトランスジェニックイネおよび同プロモーターによるアンチセンストランスジェニックィネを作製した。現在、ホモ型固定系統を取得し、OSVP1異所過剰発現トランスジェニックとの交配を行う予定である。また、OsFU3に関してはdsRNAiコンストラクトを作成し、形質転換を行った。
OSFUS3異所発現トランスジェニック植物作成の過程で生じたトランスジェニックカルスを調べたところ、貯蔵タンパク質遺伝子REG2がABA依存的に発現することが分かった。非形質転換カルスではこのような発現は観察されなかった。したがって、この貯蔵タンパク質遺伝子の発現は、OSFUS3の制御下にあることが明らかとなった。
[2]TRAB1を介したABA応答性転写制御メカニズムの解析
GBD(GAL4 DNA-binding domain)::TRAB1融合タンパク質は、GAL4結合部位をもつレポーター遺伝子にABA応答性を付与することができる。これを利用して、様々なTRAB1のdeletionやpoint mutationを調べた.その結果,N末端領域に存在するある特定のSer残基をAlaに置換すると、GBD::TRAB1のABA応答性付与能が失われた。このことから、ABAシグナルは、最終的にTRAB1のリン酸化という形で転写系に伝えられる可能性が示唆された。この仮説を証明するために,イネ培養細胞Oc株を用いてin vivoでのリン酸標識実験を行った。細胞を1時間32P無機リン酸で前標識した後ABA処理し、抗TRAB1抗体を用いて免疫沈降を行ったところ、TRAB1はABA処理後15分以内にリン酸化されることが分かった。また、簡単な細胞分画の実験からは、TRAB1はABAのあるなしに関わらず常に粗核画分に回収されることが分かった。さらに、GFP::TRAB1融合タンパク質をプロトプラストトランジエント発現系で発現させたところ、ABAの有無に関わらず、ほぼ完全な核内局在を示した。したがって、既に核に存在するTRAB1がABA依存的にリン酸化を受けるものと思われた。これらのことがら、ABAの1次シグナル伝達の最終事象はTRAB1内の特定のSer残基のリン酸化であると考えられた。現在、このリン酸化部位をタンパク質化学的に同定するための準備を進めている。すなわち、抗TRAB1抗体をアフィニティー精製し、抗体アフィニティーカラムを作成した。これを用いてリン酸化および非リン酸化状態のTRAB1を精製し、LC-MS等によってリン酸化部位を決定する予定である。
プロトプラストトランジエント系で発現させたTRAB1がウェスタンブロットにより検出可能であることが分かった。TRAB1にHISおよびHAエピトープタグを付けたコンストラクトの発現も確認した。この様な発現系をTRAB1とOSVP1と相互作用の解析を試みる予定である。