2003 Fiscal Year Annual Research Report
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12141204
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| Research Institution | National Cancer Center Research Institute and Research Center for Innovative Oncology, National Cancer Center Hospital East |
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Principal Investigator |
藤田 雅俊 国立がんセンター研究所, ウイルス部, 室長 (30270713)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
清野 透 国立がんセンター研究所, ウイルス部, 部長 (10186356)
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| Keywords | 細胞周期制御 / サイクリン / Cdk / ORC / Cdt1 / geminin / DNA障害チェックポイント系 / 染色体不安定性 / 核アクチン |
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| Research Abstract |
複製複合体の核内構築
ORC1が核高次構築の基礎としての核マトリックスに結合していること、それを足場としてG1期特異的に核マトリックス上で機能的ORC1-5複合体が形成されることを示した。siRNAを用いORC1およびCDC6がヒト細胞においてもMCMのクロマチン結合に必須であることを明らかにした。
Cdt1の細胞周期制御と染色体不安定性への関与
Cdt1はORC/CDC6と共に、MCM loading機構を形成している。S期以降は再複製防止のために、ORC/CDC6活性はCdkキナーゼにより抑制されている。Cdt1の活性制御は抑制蛋白gemininの結合によるものが主であると考えられていた。今回我々は、Cdt1がそのサイクリン結合モチーフを介してcyclin A-Cdk1/Cdk2と結合し、リン酸化されることを見出した。リン酸化によりCdt1はSCF-Skp2と結合し、分解へと導かれた。またリン酸化によりCdt1のDNA結合能が減少した。一方、Cdt1とgemininとの結合にはリン酸化は影響を及ぼさず、Cdt1はgemininとCdkリン酸化という二つの独立した機構で、S期以降機能抑制されていると考えられる。そのように厳密にCdt1活性が制御されているということは、その逸脱は重大な障害を引き起こす可能性が考えられた。実際に癌細胞株においてCdt1の過剰発現が認められた。そこでCdt1過剰発現の効果を調べたところ、染色体障害を引き起こしATM-Chk2系を活性化することがわかった。再複製は認められず、複製ストレスをモニターしているATR-Chk1系の活性化も認められなかった。Cdt1を過剰発現させた細胞を微小管阻害剤ノコダゾールで処理すると再複製が認められた。これにはATMの活性化とそれによるCdkの活性抑制が必要であることがわかった。このようにCdt1の過剰発現は染色体不安定性の一因となる可能性が考えられ、新たな興味深い知見であると考えており、さらに検討を進めている。
核アクチンの機能解析
アクチン特異的阻害剤と考えられているラトルンクリンに耐性のある変異ベータアクチンを作成し、それを過剰発現するラトルンクリン抵抗性HeLa細胞の樹立に成功した。一方、アクチンを含むBAFクロマチンリモデリング複合体の精製と活性測定法が確立出来た。今後は、これらの系にラトルンクリンを加え、活性の抑制が認められるかどうかを確認する。もし抑制が認められたなら変異アクチン発現耐性細胞から精製したBAF複合体はそれに耐性かどうかを調べる。
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[Publications] Nozomi Sugimoto: "Cdt1 phosphorylation by cyclin A-dependent kinases negatively regulates its function without affecting geminin binding."J.Biol.Chem.. (In press).
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[Publications] Ayumi Kudoh: "Inhibition of S-phase cyclin-dependent kinase activity blocks expression of Epstein-Barr virus immediate-early and early genes, preventing viral lytic replication."J.Virol.. 78. 104-115 (2004)
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[Publications] Satoshi Ohta: "The ORC1 cycle in human cells : II. Dynamic change of human ORC complex during the cell cycle."J.Biol.Chem.. 278. 41535-41540 (2003)
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[Publications] Ayumi Kudoh: "Reactivation of lytic replication from Epstein-Barr virus latently infected B-cells occurs with high S-phase CDK activity while inhibiting cellular DNA replication."J.Virol.. 77. 851-861 (2003)
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[Publications] Masatoshi Fujita: "Establishment of latrunculin A-resistance in HeLa cells by expression of a R183A D184A mutant β-actin."Oncogene. 22. 627-631 (2003)
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[Publications] Masatoshi Fujita: "DNA Replication Initiation ; in Encyclopedic References of Genomics and Proteomics in Molecular Medicine"Springer-Verlag, Heidelberg (In press).
