転写とヌクレオチド除去修復機構を共役する新規蛋白質複合体の解析

2003 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 12143203
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 田中 亀代次 大阪大学, 大学院・生命機能研究科, 教授 (80144450)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 吉野 雅文 大阪大学, 大学院・生命機能研究科, 助手 (00346149) ; 倉岡 功 大阪大学, 大学院・生命機能研究科, 助手 (60335396) ; 西條 将文 大阪大学, 大学院・生命機能研究科, 助教授 (90221986) ; 竹内 聖二 大阪大学, 大学院・生命機能研究科, 助手 (10304065)
• Keywords: DNA損傷 / DNA修復 / 転写 / スプライシング / RNAポリメラーゼII / ユビキチン / コケイン症候群 / WD40リピート

Research Abstract

転写鎖上のDNA損傷は、「転写と共役したDNA修復」(transcription-coupled repair;TCR)と呼ばれる機構により修復される。コケイン症候群(Cockayne syndrome;CS)は日光過敏性や多様な身体的、精神神経学的異常を示すヒト遺伝疾患で、TCR機構を選択的に欠損している。本研究は、CS蛋白質を始め、TCRに関与する新規蛋白質複合体の解析を行い、TCRの分子機構とその欠損病態の解明を目的とする。本年度の成果として、(1)転写およびTCRに関与するXAB2蛋白質は、6種類の構成因子からなる複合体を形成し、in vitro転写伸長反応を増強させた。siRNAでXAB2をノックダウンした細胞のTCR能は低下し紫外線高感受性となること、mRNAスプライシングにも異常を示すことを明らかにした。(2)コケイン症候群A群(CSA)蛋白質は、いわゆるWD40 repeat motifを持ち、蛋白質複合体形成に関わることが示唆された。そこで、FLAG-HA-tagged CSA cDNAを発現するHeLa細胞抽出液から、抗HA抗体・抗FLAG抗体によりCSA蛋白質複合体を精製した。質量分析によりその構成因子を同定し、CSA蛋白質複合体にはDDB1、COP9 signalosome、Roc1、Cullin4AがCSA蛋白質とstoichiometricに複合体に含まれることを明らかにした。これらの結果に一致して、CSA蛋白質複合体はユビキチン・リガーゼ(E3)活性を持つことを確認した。一方、紫外線照射した細胞の抽出液においては、RNA polymerase IIoとも結合した。TCR機構には蛋白質のユビキチン化による制御が関与することを示した。(3)紫外線損傷を1ケ所に持つDNA templateを用いたin vitro転写系を構築した。RNAポリメラーゼIIは紫外線損傷部位でリボヌクレオチドを1-2個取り込んだ後に転写を停止することを明らかにした。

Research Products

• [Publications] Isao Kuraoka: "Effects of endogeneous DNA base lesions on transcription elongation by mammalian RNA polymerase II : Implications for transcription-coupled DNA repair and transcriptional mutagenesis."J.Biological Chemistry. 278. 7294-7299 (2003)
• [Publications] Yan Ren: "Three novel mutations responsible for Cockayne syndrome group A."Genes & Genetic Systems. 78. 93-102 (2003)
• [Publications] Regina Groisman: "The ubiquitin ligase activity in the DDB2 and CSA complexes is differentially regulated by the COP9 signalosome in response to DNA damage."Cell. 113. 357-367 (2003)
• [Publications] Li Lan: "Functional and physical Interactions between ERCC1 and MSH2 complexes for resistance to cis-diamminedichloroplatinum(II) in mammalian cells."DNA Repair. 3. 135-143 (2004)
• [Publications] Naoto Inukai: "A novel hydrogen peroxide-induced phosphorylation and ubiquitination pathway leading to RNA polymerase II proteolysis."J.Biological Chemistry. (in press).
• [Publications] Fumikazu Yamazaki: "XPA gene-deficient, SCF-transgenic mice with epidermal melanin are resistant to UV-induced carcinogenesis."J.Investigative Dermatology. (in press).