腎臓における水チャネル、クロライドチャネルの細胞内動態に関する研究

2003 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 12144204
• Research Institution: Tokyo Medical and Dental University
• Principal Investigator: 内田 信一 東京医科歯科大学, 医学部附属病院, 講師 (50262184)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 佐々木 成 東京医科歯科大学, 大学院・医歯学総合研究科, 教授 (60170677)
• Keywords: CLCクロライドチャネル / AQP水チャネル / ソーティング / 免疫沈降 / MPCK細胞 / トランスジェニックマウス / 細胞内膜系 / 尿崩症

Research Abstract

1)CLC-Kクロライドチャネルのベータサブユニットであることが判明したバーチン蛋白が、いかにCLC-Kクロライドチャネルと相互作用し、CLC-Kクロライドチャネルを細胞膜に導くのか、またヒトでバーター症候群を引き起こすバーチンの変異が、バーチン自体にどのような影響を及ぼしているのかを、細胞培養系にて安定発現株を作成して検証した。
その結果、バーチンとCLC-Kは免疫沈降で共沈すること、その結合にCLC-KのNないしC末の細胞内ドメインは関与していないことが明らかになった。また、R8Lというバーター症候群を引き起こす変異体は野生型のバーチンが細胞膜に存在するのに対し、ERにとどまることが判明した。この細胞に、CLC-Kを発現させると、CLC-Kとの結合性はR8Lでも保たれているため、R8Lの存在部位に引きづられるようにCLC-KもERにとどまり細胞膜への移行が阻害された。このようにバーチン変異によるバータ症候群の分子メカニズムを解明することができた。
2)細胞内膜系のCLCクロライドチャネルであるCLC-3,4,5,6,7についてその細胞内局在に相違があるかを、培養細胞系にて検討し、CLC-3,4,5は主として初期エンドソームに、CLC-7は後期エンドソームとライソゾームに局在することが判明した。その他、タグつきCLC-3トランスジェニックマウス、CLC-4ノックアウトマウスを作成中。
3)AQP2水チャネルの変異による尿崩症のうち優性遺伝形式とる変異はC末のフレームシフト変異体である。この変異の影響を固体内で検証するため、AQP2プロモーター下に変異体AQP2を発現するトランスジェニックマウスを作成した。変異体蛋白を発現する細胞では野生型のAQP2蛋白のapical側への移行が障害されていた。動物もpartialな尿崩症を呈しており、モデルマウスが確立された。

Research Products

• [Publications] Hirofumi Maehara: "Expression of CLC-kB gene promoter in the mouse cochlea"Neuro Report. 14. 1571-1573 (2003)
• [Publications] Atsushi Hayama: "Molecular mechanisms of Bartter syndrome caused by mutations in the BSND gene"Histochem Cell Biol. 119. 485-493 (2003)
• [Publications] Teiko Ohashi: "Intracellular mislocalization of mutant poducin and correction by chemical chaperones"Histochem Cell Biol. 119. 257-264 (2003)