2000 Fiscal Year Annual Research Report
cGMP系関連遺伝子多型に基づいた循環器疾患遺伝的要因の解明とその医療への応用
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12204066
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
斎藤 能彦 京都大学, 医学研究科, 助教授 (30250260)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
岸本 一郎 財団法人生産開発科学研究所, 研究員 (80312221)
吉村 道博 熊本大学, 医学部・附属病院, 講師 (30264295)
小川 佳宏 京都大学, 医学研究科, 助手 (70291424)
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| Keywords | eNOS遺伝子 / 遺伝子多型 / SNPs / 冠攣縮性狭心症 / サプレッサー / RPA1 |
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| Research Abstract |
邦人に多発する冠攣縮性狭心症の成因を研究する上で、この成因にeNOS遺伝子異常が関与しているとの仮説に基づき、冠攣縮性狭心症と健常対象者それぞれ10名のDNAを用いて、eNOS遺伝子全エクソンと5'転写調節領域1.6Kbpにわたり、SSCP法で点変異を検索した。その結果、エクソン7のミスセンス変異(Glu298Asp変異)と、5'転写調節領域に、3カ所の点変異(T-786C,G-922C,T-1468A変異)を見つけた。
5'転写調節領域の3つの変異は同一対立遺伝子上に存在していたが、ゲルシフトアッセイ等の検討によりg-786C変異が機能的であることが示唆された。さらに、T-786C変異部位を11bp欠失させた変異リポーターを作製してルシフェラーゼアッセイを行ったところ、この欠失クローンは野生型クローンと同等までルシフェラーゼ活性が回復した。これらの結果より、T-786C変異にサプレッサー蛋白質が結合していることが示唆された。
T-786C変異近傍は既知の転写調節配列と相同性が認められず、このサプレッサーを精製することにした。この蛋白質を精製するにあたりHela細胞の核蛋白質を300mg調整し、2段階のイオン交換クロマトグラフィー、アフィニティービーズにて、SDS-PAGE上50Kdのシングルバンドに精製することに成功した。この蛋白質をゲルより抽出し、アミノ酸配列を決定した。この決定されたアミノ酸配列はreplication protein A(RPA)の部分配列と100%一致した。さらにゲルシフトのシフトバンドはRPAに対する抗体でスーパーシフトし、また、リコンビナントRPAを用いても同様のゲルシフトが確認された。さらに、RPAの転写開始点付近の塩基配列を基にしたアンチセンスをHUVECに導入すると変異型リポーター活性が有意に回復することが確認された。これらの一連の結果より変異型eNOS遺伝子の転写はRPAを介して抑制されていることが証明された。
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[Publications] K.Kuwahara: "Neuron-Restrictive Silencer Element/Neuron-Restrictive Silencer Factor System Regulates Basal-and Endothelin-1-Inducible Atrial Natriuretic Peptide Gene Expression in Ventricular Myocytes"Mol Cell Biol.. 21. 2085-2097 (2001)
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[Publications] Y.Mizuno: "Aldosterone Production is Activated in the Failing Ventricles in Humans."Circulation.. 103. 72-77 (2001)
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[Publications] I.Hamanaka: "Induction of JAB/SOCS-1/SSI-1 and CIS3/SOCS-3/SSI-3 Is Involved in gp130 Resistance in Cardiovascular System in Rat Treated with Cardiotrophin-1 (CT-1) in vivo."Circ.Res.. (In press). (2001)
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[Publications] K.Kuwahara: "Cardiotorphin-1 phosphorylates Akt and BAD, and prolongs cell survival via a PI3K-dependent pathway in cardiac myocytes."J.Mol.Cell.Cardiol.. 32. 1385-1394 (2000)
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[Publications] E.Ogawa: "Outside-in Signaling of Fibronectin Stimulates Cardiomyocyte Hypertrophy in Cultured Neonatal Rat Ventricular Myocytes"J.Mol.Cell Cardiol.. 32. 765-776 (2000)
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[Publications] S.Asai: "The Heart Is a Source of Circulating Cardiotrophin-1 in Humans"Biochem.Biophys.Res.Commun.. 279. 320-323 (2000)
