神経特異的DNAチップの作製と神経発生遺伝子ネットワークの網羅的解析

2000 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 12204112
• Research Institution: Chiba Cancer Center (Research Institute)
• Principal Investigator: 市川 美紀 (大平 美紀) 千葉県がんセンター, 研究局・生化学研究部, 研究員 (20311384)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 磯貝 恵理子 千葉県がんセンター, 研究局・生化学研究部, 研究員 (40300917)
• Keywords: DNAチップ / 網羅的発現解析 / 神経芽腫 / オリゴキャップcDNAライブラリー

Research Abstract

神経発生に関わる遺伝子ネットワークを大規模に解析することを目指し、神経芽腫に発現する遺伝子の大量クローニングおよびそのDNAチップの作製を進めている。本年度は以下を行った。
1)オリゴキャップcDNAライブラリーからのDNAチップに用いる遺伝子の収集
予後良好群および予後不良群の神経芽腫オリゴキャップcDNAライブラリーから約2000クローンずつ単離し、両端シーケンシングを終了した。相同性検索の結果、新規の可能性があるクローンは約4割であった。両群の間で出現する既知遺伝子が明らかに異なっており、異なるサブセットを材料として用いることで、神経系の遺伝子をより網羅することができると考えられた。
2)テストチップの作製
予後良好群ライブラリーからのクローン約2000クローンと、コントロールとして用いる既知遺伝子17個をドットしたテストチップを作製し、ハイブリダイゼーション条件を決定した。このチップを用いて神経芽腫細胞株へのレチノイン酸を用いた分化誘導により8つの遺伝子の発現量の変化(2倍以上)を同定した。同じRNAを用いた半定量RT-PCRの結果、そのうち6つの遺伝子について再現性が見られた。現在さらに予後不良群を加えたチップの作製を進めている。
3)予後良好群および不良群の間で発現に差のある遺伝子の同定
両群で発現量が有意に異なる遺伝子を各群16症例ずつを用いた半定量RT-PCRにより検索した。予後良好群ライブラリーからの1269種類の遺伝子について検討を行ったところ、207種類の遺伝子において両群における発現量が異なっていた。このうち101種類は未知遺伝子であった。一部については定量real-timePCRにより差を確認した。予後良好群で高く不良群で低い発現を示す遺伝子群には、シナプス小胞輸送に関わる遺伝子(RABなど)や、神経堤由来細胞の分化増殖に関与する転写因子(TFAP2B)などが含まれていたことから、差が見られた新規遺伝子についても神経の分化増殖シグナルの経路に関与してくる可能性があり、今後の解析が必要と考えられた。これらの半定量PCRの結果は、新たな神経分化関連遺伝子の同定に結びつくと共に、今後のチップ実験を行う際に良いコントロールとなり、また、それぞれの方法の比較検討を可能にするため、非常に有用であると考えられる。

Research Products

• [Publications] Ohira M,Shishikura T, et al.: "Hunting the subset-specific genes of neuroblastoma : expression profiling and differential screening of the full-length-enriched oligo-capping cDNA libraries."Med.Pediatr.Oncol.. 35. 547-549 (2000)
• [Publications] Kawamoto T,Ohira M, et al.: "Association between favorable neuroblastoma and high expression of the novel metalloproteinase gene, nbla3145/XCE, cloned by differential screening of the full-length-enriched oligo-capping neuroblastoma cDNA libraries"Med.Pediatr.Oncol.. 35. 628-631 (2000)
• [Publications] Nakagawara A,Ohira M, et al.: "Identification of the homozygously deleted region at chromosome 1p36.2 in human neuroblastoma."Med.Pediatr.Oncol.. 35. 516-521 (2000)
• [Publications] Furuta S,Ohira M, et al.: "Analysis of loss of heterozygosity at 16p12-p13 (familial neuroblastoma locus) in 470 neuroblastomas including both sporadic and mass screening tumors."Med.Pediatr.Oncol.. 35. 531-533 (2000)
• [Publications] Ohira M,Kageyama H, et al.: "Identification and characterization of a 500-kb homozygously deleted region at 1p36.2-p36.3 in a neuroblastoma cell line."Oncogene. 19. 4302-4307 (2000)
• [Publications] Nagai M,Ohira M, et al.: "Identification of the full-length KIAA0591 gene encoding a novel kinesin-related protein which is mapped to the neuroblastoma suppressor gene locus at 1p36.2."Int.J.Oncol.. 16. 907-916 (2000)
• [Publications] Islam A,Ohira M, et al.: "High expression of Survivin, mapped to 17q25, is significantly associated with poor prognostic factors and promotes cell survival in human neuroblastoma."Oncogene. 19. 617-623 (2000)
• [Publications] Hanaoka E,Ohira M, et al.: "Molecular cloning and expression analysis of the human DA41 gene and its mapping to chromosome 9q21.2-q21.3."J Hum Genet.. 45. 188-191 (2000)
• [Publications] Ozaki T,Ohira M, et al.: "NFBD1/KIAA0170 is a novel nuclear transcriptional transactivator with BRCT domain."DNA Cell Biol.. 19. 475-485 (2000)