p27^<Kip1>新規分子種の同定とがん抑制因子としての機能解明

2000 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 12213103
• Research Institution: Kyushu University
• Principal Investigator: 平野 勝也 九州大学, 大学院・医学研究院, 講師 (80291516)
• Keywords: 細胞周期 / サイクリン依存性キナーゼ / p27^<Kip1> / アイソフォーム / 蛋白質分解

Research Abstract

血管内皮細胞cDNAライブラリーからサイクリン依存性キナーゼ阻害蛋白質p27^<Kip1>の新規分子種をクローニングした。新規分子種は、従来種とは異なるC末端を有するスプライスアイソフォームである。細胞抽出液を用いた分解アッセイを行ったことろ、従来種は増殖期の細胞抽出液によって1時間以内に分解されたのに対し、新規分子種は抵抗性であった。このことから新規分子種を、p27^<Kip1R>(degradation-resistant isoform of p27^<Kip1>)と命名した。新規分子種を緑色蛍光色(GFP)との融合蛋白質として培養細胞に発現させると、従来種と同様に核へ局在することが明かとなった。GFP蛍光顕微鏡画像解析により核局在の程度を定量評価する方法を確立し、従来種の変異体を解析したところ、従来種の核移行シグナルは2分裂型であり、領域153〜166が核移行に必要最小限の領域であることを明らかにした。ところが、従来種と新規分子種の共通領域では核への特異的集積が消失した。このことから、新規分子種に特異的なC末端領域にも核移行に必要は配列があり、新規分子種の核移行シグナルも2分裂型であることが示唆された。GFP蛍光を指標に、フローサイトメーターを用いて、組換え蛋白質発現陽性及び陰性細胞の増殖を評価する方法を確立した。すなわち、遺伝子導入後各時点で、総細胞数を計測し、発現陽性細胞の割合を求め、両者から発現陽性及び陰性細胞の細胞数を算出し、増殖の時間経過を評価した。ヒト子宮頚癌由来HeLa細胞に新規分子種を発現させると、従来種同様、G_1期からS期への移行を阻害し、がん細胞の細胞増殖を完全に停止させた。さらに、新規分子種を発現する細胞の^<**>%の細胞にアポトーシスを誘導した。試験管内の実験から新規分子種はがん抑制因子としての機能を果たすことが示唆された。

Research Products

• [Publications] Hirano K,Hirano M,Zeng Y,Nishimura J,Kanaide H: "Cloning and functional expression of a degradation-resistant novel isoform of p27^<Kip1>."Biochemical Journal. 353. 51-57 (2001)
• [Publications] Zeng Y,Hirano K,Hirano M,Nishimura J,Kanaide H: "Minimal requirement for nuclear localization of p27^<Kip1>, a cyclin-dependent kinase inhibitor."Biochemical and Biophysical Research Communications. 274. 37-42 (2000)
• [Publications] Hirano K,Hirano M.Eto W,Nishimura J,Kanaide H: "Mitogen-induced upregulation of non-smooth muscle isoform of α-tropomyosin in rat aortic smooth muscle cells."European Journal of Pharmacology. 406. 209-218 (2000)
• [Publications] Morisaki T,Matsunaga H,Beppu K,Ihara E,Hirano K,Kanaide H, et al: "A combination of cyclosporin-A (CsA) and interferon-gamma (IFN-γ) induces apoptosis in human gastric carcinoma cells."Anticancer Research. 20. 3363-3374 (2000)
• [Publications] Toshima J,Hirano K,Nishimura J,Nakano H,Kanaide H: "Differential effects of progesterone and 17β-estradiol on the Ca^<2+> entry induced by thapsigargin and endothelin-1 in in situ endothelial cells."Biochimica et Biophysica Acta. 1499. 109-121 (2000)