低分子量G蛋白質の活性化状態の可視化と細胞形態変化への関与

2000 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 12215092
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 岩根 敦子 大阪大学, 医学系研究科, 助手 (30252638)
• Keywords: 低分子量G蛋白質 / 蛍光エネルギー移動法 / イメージング

Research Abstract

近年、正常細胞における外界適応や、癌細胞の運動性等を冗進する因子の1つとして、様々な低分子量G蛋白質が深く関与していることが明らかにされてきた。しかし、実際に低分子量G蛋白質が、細胞中の何処でどの様な時間経過でどれ位の分子数が活性化されると細胞の形態変化や細胞接着・運動性等との関係するのかは未だ不明な点が多い。これらを明らかにするために、生きた細胞中で低分子量G蛋白質の活性化状態や動的振る舞いを蛍光エネルギー移動法(FRET)を用いて可視化する事を目的としている。今年度は(1)蛍光色素や蛍光蛋白質が目的のイメージングに適しているように顕微鏡を開発、(2)H-Ras組換え体への蛍光色素(IC5)の特異的な部位(Cys118)への導入や、(3)GTPの蛍光色素の標識化(Cy3-GTP)を行い、(4)G蛋白質の活性化状態の可視化に成功、さらにプレリミナリー結果ではあるが(5)GTP結合Rasの動的構造多形成を示唆するIC5-RasとCy3-GTPのFRETを観察し、さらに(6)活性化状態のTMR-RasとRafとの動的な相互作用を1分子レベルで観察した。細胞中のどの様な場所でどの様な時間経過での起こる変化なのかはin vitroの実験結果だけでは未だ解らないが、生きた細胞を用いてRaf-1のEGF刺激に対する動態を蛍光蛋白質GFPの変異体であるYFPとのキメラ蛋白(YFP-Raf-1)を用いてイメージングし、EGF刺激後の細胞質から膜に移行する過程を観察することも出来てきたので、この技術を応用して低分子量G蛋白質の細胞内動態もこれから解明出来るであろうという目処は立ってきた。将来的には細胞の形態変化等を追従しながら低分子量G蛋白質の動態との関係を明らかにしたい。

Research Products

• [Publications] Toshio Yanagida: "A large step for myosin."Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 97. 9357-9359 (2000)
• [Publications] Toshio Yanagida: "Single molecule techniques inbiophysics."The proceedings of the 9^<th> international conference on Na/K Pump and related pumps.ISC. 1207 (2000)
• [Publications] Yoshikazu Miyamoto: "Direct Inhibition of Microtubule-based Kinesin Motility by Local Anesthetics."Biophys.J.. 78. 940-949 (2000)
• [Publications] Toshio Yanagida: "Single molecule analysis of the actomyosin motor."Current Opinion in Cell Biology.. 12. 20-25 (2000)
• [Publications] Toshio Yanagida: "Single motor mechanics and models of the myosin motor."The Royal Society Philosophical Transactions B.. 355. 1-7 (2000)
• [Publications] Atsuko Hikikoshi Iwane: "Visualization of dimerization using fluorescence resonance energy transfer (FRET) imaging between biofluorescent proteins."Biophysics. 40. 177 (2000)
• [Publications] Hideyuki Matsuura: "Single molecule imaging of small G protein Ras."Biophysics. 40. 32 (2000)
• [Publications] Kazuo Kitamura: "A single myosin head moves along an actin filaments with regular steps during one biochemical cycle of ATP hydrolysis."Biophysics. 228. 89-93 (2000)
• [Publications] Kayo Hibino: "Spatiotemporal dynamics of Ras/cRaf-1 interaction in the plasma membrane of living cells."Biophysics. 40. 76 (2000)
• [Publications] Hiroto Tanaka: "The step size, processivity, and velocity of myosinV are independent on its neck length."Biophysics. 40. 202 (2000)
• [Publications] Kazuo Kitamura: "Single molecule analysis of actomyosin motor : Load dependece."Biophysics. 40. 202 (2000)
• [Publications] Yuji Kimura: "Laser trappong nanometry with DIG DNA probe."Biophysics. 40. 203 (2000)
• [Publications] Atsuko Hikikoshi Iwane: "Visualization of protein dimerization using fluorescence resonance energy transfer imaging between biofluorescent proteins."第23回 日本分子生物学会年回. 684 (2000)
• [Publications] Yoshiyuki Arai: "Behavior of small G protein Ras revealed by single molecule imaging."第23回 日本分子生物学会年回. 684 (2000)
• [Publications] Tomonobu Watanabe: "Single molecule imaging of the process of regulation by the kinesin tail domain."第23回 日本分子生物学会年回. 797 (2000)
• [Publications] Hiroto Tanaka: "The motor domain, not a long neck domain, determines the large step of myosin V."Biophysical J.. 80. 81a (2001)
• [Publications] 岩根敦子: "GFPとバイオイメージング"羊土社. 10 (2000)