高度水環境管理技術のための定量微生物工学手法の確立

2000 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 12305032
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 大垣 眞一郎 東京大学, 大学院・工学系研究科, 教授 (20005549)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 遠藤 銀朗 東北学院大学, 工学部, 教授 (80194033) ; 藤田 正憲 大阪大学, 工学研究科, 教授 (70029289) ; 大村 達夫 東北大学, 工学研究科, 教授 (30111248) ; 原田 秀樹 長岡技術科学大学, 環境システム工学系, 教授 (70134971) ; 津野 洋 京都大学, 工学研究科, 教授 (40026315)
• Keywords: 微生物 / 水環境 / 上下水道 / 遺伝子 / PCR / 定量 / 酵素

Research Abstract

本研究では、微生物の免疫機能の発現による抗原-抗体法を用いて計数する方法により、し尿処理場より分離した好気性脱窒菌Pseudomonas sp.DNY8株の混合培養系における検出・計数法を開発した。また、テトラクロロエチレンを嫌気性条件で分解する菌の集積培養を、活性炭流動床で行い、分離準備にかかっている。
従来より定量が非常に困難とされてきた下水汚泥中の病原ウイルスを,酵素を用いた固形物分解により効率的に誘出し(EVE法),そのウイルス数をRT-PCR法により定量した。ポリオウイルスを汚泥にスパイクした実験では,この方法により約40%のウイルスを回収することができ,これは現在の標準手法よりも2倍以上も高い効率であった.
自然環境中の微生物群集はRNA含量が少ないため、FISH法では目的微生物の検出が困難である。そこで、菌数の増加を抑えながら菌体を活性化(RNA含量を増やす)することが出来るDirect Viable Count(DVC)法とFISH法と組み合わせて検出・定量化する手法を開発し、シベリア湿地帯より取得した土壌サンプル中のメタン生成古細菌に適用した。
カテコール1,2-オキシゲナーゼ、およびカテコール2,3-オキシゲナーゼ遺伝子の共通塩基配列に基づいたプライマーをデザインし、PCR法により自然環境中に存在する芳香族化合物分解菌の半数以上を検出できるシステムを開発した。また、環境試料中から高い収率で純度の高いDNAを抽出する手法を確立した。
有機水銀耐性をもつ世界の異なる地域から分離した3種の細菌について、メチル水銀、フェニル酢酸水銀、エチル水銀等の分解に関与するmerB遺伝子をPCR法およびサザンハイブリダイゼーション法によって検出できることを明らかにした。また、このmerB遺伝子は3つの異なる遺伝子に分けられることを明らかにした。

Research Products

• [Publications] D.Sano,K.Fukushi,K.Yano,Y.Yoshida and T,Omura: "Enhanced Virus Recovery from Municipal Sewage Sludge with Combination of Enzyme and Cation Exchange Resin"Water.Science and Technology. 43(2). 75-82 (2001)
• [Publications] M asaru Narita,Chei-Chen Huang,Takuya Koizumi,Takeshi Yamagata,Ginro Endo: "Identification and characterization of anaerobic mercury-resistant bacteria isolated from mercury-polluted sediment."Water Science and Technology. Vol.42 No.3-4. 109-114 (2000)
• [Publications] T.Tagawa,K.Syutsubo,Y.Sekiguchi,A.Ohashi and H.Harada: "Quantification of methanogen cell density in anaerobic granular sludge consortia by fluorescence in-situ hybridization."Wat.Sc.& Tech.. vol.42 No.3-4. 77-82 (2000)
• [Publications] Shutsubo K.,Sinthurat N.,Ohashi A.& Harada H.: "Population Dynamics of Anaerobic Microbial Consortia in Thermophilic Granular Sludge in Response to Feed Composition Change"Wat.Sc.& Tech. vol.43 No.1. 59-66 (2001)
• [Publications] Imachi,H.,Sekiguchi T.,Kamagata Y.,Ohashi A.and Harada H.: "Cultivation and Situ Detection of a Thermophilic Bacterium.Capable of Oxidizing Propionate in Syntr ophic Association with Hydrogenotrophic Methanogens in a Thermophilic Methanogenic Granular Sludge"Appl.Environ.Microbiol.. vol.66. 3608-3615 (2000)
• [Publications] Kazunari Sei,Ken-ichiro Asano,Naohiro Tateishi,Kazuhiro Mori,Michihiko Ike,Tetsuro Kohno,and Masanori Fujita: "Development of Simple Methods of DNA Extraction from Environmental Samples for Monitoring Microbial Community Based on PCR"Japanese Journal of Water Treatment Biology. Vol.36,No.4,. 193-204 (2000)