2002 Fiscal Year Annual Research Report

機能性核酸を用いた生体における遺伝子機能解析プロセスの開発

Research Project

Project/Area Number	12305052
Research Institution	The University of Tokyo
Principal Investigator	多比良和誠東京大学, 大学院・工学系研究科, 教授 (10261778)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	川崎広明東京大学, 大学院・工学系研究科, 助手 (60332623) 宮岸真東京大学, 大学院・工学系研究科, 助手 (30323538)
Keywords	リボザイム / アポトシス / RNAヘリケース / ジーンディスカバリー / poly A
Research Abstract	昨年度は、リボザイムにヘリケース結合活性を有するCostitutive Transport Element(CTE配列)を導入することにより、mRNAの2次構造をほどきながら切断する、スライディングリボザイムの開発を行った。このリボザィムを用いることにより、特定の遺伝子のノックダウンがこれまでに比べて極めて容易に、しかもより高いレベルで可能になった。今年度はまず、ヘリケース結合活性を有する他の配列としてmRNAの3'側に付加されるpoly A配列が同様の効果を有するかどうかの検討を行った。その結果、in vitro, in vivo共に、poly A配列を付加することにより、RNAの2次構造の影響されずに効率よく、RNAを切断できることが明らかになった。また、poly A配列がリクルートしているヘリケースはeIF4AIであることを同定した。次にこのpoly A付加型リボザイムを用いて、基質認識配列をランダマイズしたリボザイムライブラリーを構築し、TNF-αによるアポトシスに関与する因子の探索を試みた。MCF-7細胞にレトロウイルスベクターを用いて構築したリボザイムライブラリーを感染させ、TNFαでアポトシスを誘導し、生き残った細胞からリボザイムをPCRによって回収し、その配列をシークエンスしたところ、アポトシスに関与していることが知られているTRADD, caspases 2 and 8, RIP, RAIDD, TRAF 2, Ets1, Bakなどの配列が見出された。また、これらのリボザイムを細胞に導入すると有意にTNF-αによって誘導されるアポトシスを阻害した。この結果から、poly A付加型リボザイムライブラリーを用いて、機能を指標としたスクリーニング(ジーンディスカバリー)が実際に可能であることを示した。また、このスクリーニングで新たに30遺伝子がアポトシスの抑制に働くことが明らかになった。同様のスクリーニング系を用いて、Fasによって誘導されるアポトシスに対してもスクリーニングを行ったところ52個のアポトシスの誘導を抑制する因子が同定された。来年度はこのリボザイムを用いたジーンディスカバリーを他のスクリーニング系で行いたいと考えている。

Research Products
(6 results)

All Other

All Publications (6 results)

[Publications] Hiroaki Kawasaki: "Identification of genes that function in the TNF-alpha-mediated apoptotic pathway using randomized hybrid ribozyme libraries"Nature Biotechnol.. 20・4. 376-380 (2002)
[Publications] Hiroaki Kawasaki: "A functional gene discovery in the Fas-mediated pathway to apoptosis by analysis of transiently expressed randomized hybrid-ribozyme libraries"Nucleic Acids Res.. 30・16. 3609-3614 (2002)
[Publications] Hiroaki Kawasaki: "Identification of genes by hybrid ribozymes that couple cleavage activity with the unwinding activity of an endogenous RNA helicase"EMBO Rep.. 3・5. 443-450 (2002)
[Publications] Mayu Iyo: "Allosterically controllable maxizymes for molecular gene therapy"Curr Opin Mol Ther.. 4・2. 154-165 (2002)
[Publications] Eigo Suyama: "Identification of a caspase 3-independent role of pro-apoptotic factor Bak in TNF-alpha-induced apoptosis"FEBS Lett.. 528. 63-69 (2002)
[Publications] Masayuki Sano: "Novel method for selection of tRNA-driven ribozymes with enhanced stability in mammalian cells"Antisense Nucleic Acid Drug Dev.. 12・5. 341-352 (2002)

2002 Fiscal Year Annual Research Report

機能性核酸を用いた生体における遺伝子機能解析プロセスの開発

Principal Investigator

多比良 和誠 東京大学, 大学院・工学系研究科, 教授 (10261778)

Research Products

[Publications] Hiroaki Kawasaki: "Identification of genes that function in the TNF-alpha-mediated apoptotic pathway using randomized hybrid ribozyme libraries"Nature Biotechnol.. 20・4. 376-380 (2002)

[Publications] Hiroaki Kawasaki: "A functional gene discovery in the Fas-mediated pathway to apoptosis by analysis of transiently expressed randomized hybrid-ribozyme libraries"Nucleic Acids Res.. 30・16. 3609-3614 (2002)

[Publications] Hiroaki Kawasaki: "Identification of genes by hybrid ribozymes that couple cleavage activity with the unwinding activity of an endogenous RNA helicase"EMBO Rep.. 3・5. 443-450 (2002)

[Publications] Mayu Iyo: "Allosterically controllable maxizymes for molecular gene therapy"Curr Opin Mol Ther.. 4・2. 154-165 (2002)

[Publications] Eigo Suyama: "Identification of a caspase 3-independent role of pro-apoptotic factor Bak in TNF-alpha-induced apoptosis"FEBS Lett.. 528. 63-69 (2002)

[Publications] Masayuki Sano: "Novel method for selection of tRNA-driven ribozymes with enhanced stability in mammalian cells"Antisense Nucleic Acid Drug Dev.. 12・5. 341-352 (2002)

多比良和誠東京大学, 大学院・工学系研究科, 教授 (10261778)