2003 Fiscal Year Annual Research Report
| Project/Area Number |
12306005
|
|---|
| Research Institution | The University of Tokyo |
|---|
Principal Investigator |
正木 春彦 東京大学, 大学院・農学生命科学研究科, 教授 (50134515)
|
|---|
| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
日高 真誠 東京大学, 大学院・農学生命科学研究科, 助教授 (50183918)
|
|---|
| Keywords | 大腸菌 / コリシン / リボヌクレアーゼ / tRNA / tRNase / アンチコドン / 反応機構 / O157 |
|---|
| Research Abstract |
1.コリシンE5の構造と反応機構:コリシンE5は、そのC末端活性ドメインE5-CRDの作用で、Tyr, His, Asn, AspのtRNAのアンチコドンのG/U間を切断して大腸菌を殺す。合成基質GpUpは特異性を保持したよい基質だが、GpUは大きく活性を失う。これらを基質とする様々な変異体の活性を比較検討し、またE5-CRDのX線結晶構造解析を単体、dGpUとの共結晶、dGpUpとの共結晶に関して行うことによって、E5-CRDと基質との特異的相互作用が明らかになった。また触媒機構も、関与するそれぞれのアミノ酸残基の役割を含めて、全く新しいRNA鎖開裂機構を明らかにすることができた。
2.コリシンDの構造と反応機構:コリシンDはそのC末端活性ドメインD-CRDの作用で、4種類のArgのtRNAのアンチコドンループを切断して大腸菌を殺す。E5-CRDの基質認識と比べてD-CRDはより多くのヌクレオチドを認識する。推定された認識機構モデルに従い、切断されないTRNA基質を点変異させて切断される基質に変えることを通じてモデルを確認した。また触媒活性に関与する可能性のあるアミノ酸を変異させて反応機構を推定した。
3.大腸菌O157株コレクションからの新規コリシンの探索:約2200種類のO157株を一次スクリーニングして、未同定となっていたコリシン生産菌85種類から新規コリシンを探索した。PCRでコリシンD活性ドメイン遺伝子を持つと考えられるものが39株存在し、このうち38株では実際にtRNase活性が確認された。そのうち35株は既知のD-CRDと同一配列をもち、3株では配列が一部異なっていたが、immunity表現型ではコリシンDと区別できなかった。また上記未同定株中、D-CRD様配列を持たない株からの抽出液の活性をスクリーニングしたが、新たなtRNase活性は見いだせなかった。
|
