2000 Fiscal Year Annual Research Report
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12308032
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| Research Institution | Tokyo Metropolitan Institute of Gerontology |
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Principal Investigator |
鈴木 紘一 (財)東京都老人総合研究所, 所長 (80011948)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
反町 洋之 東京大学, 農学生命科学研究科, 助教授 (10211327)
猪股 光司 (財)東京都老人総合研究所, 分子生物学研究系・蛋白質生化学部門, 研究員 (30142649)
岩下 淑子 (財)東京都老人総合研究所, 分子生物学研究系・蛋白質生化学部門, 室長 (50111498)
前田 達哉 東京大学, 分子細胞生物学研究所, 助教授 (90280627)
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| Keywords | カルパイン / プロテアーゼ / 活性化機構 / カルシウム / リン脂質 |
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| Research Abstract |
カルパインのX線解析の結果、機能が不明だったドメインIII(III)が、カルシウムイオン(Ca)、リン脂質結合部位として知られるC2ドメインと類似の構造を持つことが明らかになり、IIIがカルパインの新しいCa結合部位、生体膜結合部位として機能するカルパインの新しい活性化機構が想定された。本研究では新しい活性化機構を検証するため、IIIが予想通りCaと生体膜を結合するかを検討した。
ラットのμ、m-カルパイン、およびショウジョウバエ(d)のIIIを大腸菌で発現させるとすべて封入体となって可溶化できなかったが、発現条件や可溶化条件を検討した結果、比較的低い蛋白質濃度ではμIIIおよびdIIIを可溶化する条件を見出した。精製したμとdIIIを用いてCaと生体膜の結合実験を行った。(1)SDSゲル電気泳動におけるIIIの移動度はCa存在下で特異的に変化した。これはCa結合蛋白質に一般的に見られる性質と同一である。(2)放射性Caを使い、膜に転写したμIIIとdIIIは、典型的なCa結合ドメインとして知られているカルパイン中のカルモジュリンドメイン(IV)と同程度のCa結合能を示した。(3)IIIのCa結合能はイノシトールリン脂質を含むリポソームを加えると2-10倍に増強した。(4)IIIとイノシトールリン脂質を含むリポソームとの結合をスピンカラム法で検定した結果、IIIはリポソームに結合し、その結合はCaで大幅に増強された。これらの結果はいずれもIIIがCaとリン脂質、すなわち、生体膜を同時に結合できることを示し、高次構造から推定した活性化機構の妥当性を支持している。
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[Publications] Masumoto,H., et al.: "Crystallization and preliminary X-ray analysis of recombinant full-length human m-calpain."Acta Crystallogr.. D56. 73-75 (2000)
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[Publications] Strobl,S., et al.: "The crystal structure of calcium-free human m-calpain suggests an electrostatic switch mechanism for activation by calcium."Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 97. 588-592 (2000)
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[Publications] Sorimachi,H., et al.: "Limb-girdle muscular dystrophy with calpain 3 (p94) gene mutations (calpainopathy)."NeuroScience News. 3. 20-27 (2000)
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[Publications] Kitagaki,H., et al.: "Autolysis of calpain large subunit inducing irreversible dissociation of stoichiometric heterodimer of calpain."Biosci.Biotech.Biochem.. 64. 689-695 (2000)
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[Publications] Tagawa,K., et al.: "Myopathy phenotype of transgenic mice expressing active site-mutated inactive p94 skeletal muscle-specific calpain, the gene product responsible for limb girdle muscular dystrophy type 2A."Human Molecular Genetics. 9. 1392-1402 (2000)
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[Publications] Xiang-Ping H., et al.: "Identification of a glutamic acide and aspartic acid residue essential for catalytic activity of asdpergillopepsin II, a non-pepsin type acid proteinase."J.Biol.Chem.. 275. 26607-26614 (2000)
