2000 Fiscal Year Annual Research Report
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12308035
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| Research Institution | Keio University |
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Principal Investigator |
木下 一彦 慶應義塾大学, 理工学部, 教授 (30124366)
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| Keywords | F1-ATPase / 回転ポテンシャル / トルク / 磁気ピンセット / 蛍光性ATPアナログ / ステップ回転 / 結晶化 |
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| Research Abstract |
特別推進研究の採択が決まり、この基盤研究の予算残高を返金した。7月までの研究報告は以下の通りです。
単一分子回転モーターであるF1-ATPaseにつき、以下の実験を行って回転ポテンシャルの決定を試みた。
1.ビーズの粘性抵抗によるトルク測定
F1-ATPaseの回転子であるγサブユニットに種々の大きさのプラスチックビーズを1個ないし2個結合させ、その回転速度から駆動トルクを見積もった。最高速度の10分の1以下では、速度によらず約40pNnmという一定のトルクが得られた。トルクは回転角によらず、回転ポテンシャルは線形ということになる。
2.磁気ピンセットによる停止トルクの測定
1では摩擦抵抗に対するトルクを計測したが、保存力に対するトルクを見積もるため、γサブユニットに磁気ビーズを結合させ、外部磁界によりトルクを与えた。F1のトルクと外部トルクが釣り合うところでF1の回転が停止する。実験系ができたばかりでまだデータが少ないが、やはり角度にほとんどよらないトルクが得られた。
3.蛍光性ATPアナログによるATP結合と回転の同時測定
無偏光エバネッセント励起光学系を製作し、F1-ATPaseへの蛍光性ATPアナログ(Cy3ATP)の結合の1分子観察を行った。同時にγサブユニットに結合させたビーズの回転も観察したところ、Cy3ATPの結合と同時に120度のステップ回転をすることが分かった。途中の角度で止めてCy3ATPの結合頻度を観察することにより、回転ポテンシャルのヌクレオチド依存性を決定すべく、準備を進めた。
4.F1-ATPaseの結晶化
回転ポテンシャルの基となる分子構造を明らかにするため、結晶化の準備を行った。
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[Publications] Satoshi P.Tsunoda,et al.: "Observations of rotation within the FcF_1-ATP synthase : deciding between rotation of the FeC Subunit ring and artifact."FEBS Lett.. 470. 244-248 (2000)
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[Publications] Kengo Adachi,et al.: "Stepping rotation of F_1-ATPase visualized through angle-resolved single-fluorophore imaging."Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 97. 7243-7247 (2000)
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[Publications] Takayuki Nishizaka,et al.: "Characterization of single actomvosin rigor bonds : Load-dependence of lifetime and mechanical properties."Biophys.J.. 79. 962-974 (2000)
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[Publications] Kiyotaka Y.Hara,et al.: "The role of the DELSEED motif of the β subunit in rotation of F_1-ATPase."J.Biol.Chem.. 275. 14260-14263 (2000)
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[Publications] Yoshie Harada,et al.: "Direct observation of DNA rotation during transcription by Escherichia coli RNA polymerase."Nature. 409. 113-115 (2001)
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[Publications] Ryohei Yasuda,et al.: "Resolution of distinct rotaitoral submillisecond kinetic analysis of F_1-ATPase."Nature. (in press).
