ユビキチン様タンパク質結合系の解析と生理的役割の解明

2001 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 12308037
• Research Institution: Okazaki National Research Institutes
• Principal Investigator: 大隅 良典 岡崎国立共同研究機構, 基礎生物学研究所, 教授 (30114416)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 大隅 正子 日本女子大学, 理学部, 教授 (60060646) ; 鎌田 芳彰 岡崎国立共同研究機構, 基礎生物学研究所, 助手 (20291891)
• Keywords: オートファジー / オートファゴソーム / APG4 / APG8 / APG7 / APG3 / タンパク質の脂質修飾 / ユビキチン様タンパク質

Research Abstract

酵母のオートファジーに必須な2つのユビキチン様蛋白質の機能解析をさらに進めた。本年度に得られた主な成果は以下の通りである。ユビキチン様蛋白質、Apg12はApg5と共有結合を形成するが、この結合体はApg16によって約300kDの複合体を形成することによって始めて機能し得ることが明らかとなった。第2のユビキチン様蛋白質、Apg8は前駆体として合成され、Apg4によって末端アルギニンが切断され、グリシンを露出する。Apg12と共通の活性化酵素Apg7により活性化され、Apg3を経て膜リン脂質ホスファチジルエタノールアミンに結合する。Apg12経路の欠損株ではApg8PEの量が著しく低下することから、この2つの経路は独立に働き得るが、相互に密接に関連している。Apg蛋白質に蛍光蛋白質を融合して細胞内における局在及び動態を観察した結果、これらの結合体が他のApg蛋白質が共存する構造体を発見し、前オートファゴソーム構造と名付けた。この構造上でオートファゴソームが形成されることも明らかとなった。Apg8の脂質化反応の機序を明らかとすることを目的として、この反応に関わる3つの因子を大腸菌内で発現し、これらの因子のみでApg8の脂質修飾が起こり得ることを証明した。さらに精製蛋白質と、ホスファチジルエタノールアミンを含むリポソームを用いた再構成に成功した。PEへの修飾にはリポソームのPE含量が重要な要因であることが明らかとなった。

Research Products

• [Publications] Kihara, A. et al.: "Two distinct Vps34 PtdIns 3-kinase complexes function in autophagy and CPY sorting in Saccharomyces cerevisiae"J. Cell. Biol.. 152. 519-530 (2001)
• [Publications] Kihara, A. et al.: "Beclin-phsophatidylinositol 3-kinase complex functions at the trans-Golgi network"EMBO Report. 2. 330-335 (2001)
• [Publications] Mizushima, N. et al.: "Dissection of autophagosome formation using Apg5-deficient mouse embryonic stem cells"J. Cell. Biol.. 152. 657-668 (2001)
• [Publications] Komatsu, M. et al.: "The C-terminal region of an Apg7p/Cvt2p is required for homodimerization and is essential for its El-activity and E1-E2 complex-formation"J Biol Chem.. 276. 9846-9854 (2001)
• [Publications] Kim, J.: "Cvt9/Gsa9 functions in sequestering selective cytosolic cargo destined for the vacuole"J. Cell. Biol.. 153. 381-396 (2001)
• [Publications] Shintani, T. et al.: "Apg2p functions in autophagosome formation on the perivacuolar structure"J Biol Chem.. 276. 30452-30460 (2001)
• [Publications] Ishihara, N. et al.: "Autophagosome requires specific early Sec proteins for its formation and NSF/SNARE for its fusion to the vacuole"Mol. Biol. Cell. 12. 3690-3702 (2001)
• [Publications] Suzuki, K. et al.: "The pre-autophagosomal structure organized by concerted functions of APG genes i essential for autophagosome formation"EMBOJ.. 20. 5971-5981 (2001)
• [Publications] Ohsumi Y.: "Molecular dissection of autophagy : two ubiquitin-like systems"Nat. Rev. Mol. Cell Biol.. 2. 211-216 (2001)