1分子機能イメージング顕微鏡の開発と細胞内情報伝達研究への応用

2000 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 12357001
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 柳田 敏雄 大阪大学, 医学系研究科, 教授 (30089883)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 岩根 敦子 大阪大学, 医学系研究科, 助手 (30252638) ; 佐甲 靖志 大阪大学, 医学系研究科, 助教授 (20215700)
• Keywords: 電気生理 / 人工膜 / イオンチャネル / 全反射顕微鏡 / 蛍光顕微鏡 / 蛋白構造 / パッチクランプ

Research Abstract

細胞膜の情報伝達分子の反応を1分子可視化計測するための光学顕微鏡(1分子機能イメージング顕微鏡)を開発し、この方法を用いて、人工膜および細胞膜中で、チャネル1分子の構造変化とイオン透過機能の相関の解析、ホルモン受容体-G蛋白質-チャネル分子間の情報伝達の1分子測定をおこなうことが本研究の目的である。
本年度は、パッチ膜中で1分子光学測定と電流測定を同時に行う方法を開発した。蛍光ラベルした脂質を含む人工脂質二重層膜を、ポリプロピレンシートに開けた小孔(直径約100mm)に形成し、その蛍光像をカメラで観察した。脂質膜は、アガロースコートしたガラス表面に接触させた状態で保持し、エバネッセント照明による観察を可能にした。膜電位は、パッチクランプアンプにより固定した。上記人工膜は、膜電位±100mVの範囲で、電気的に安定であった。この膜上で、蛍光脂質1分子のブラウン運動を観察することができた。次ぎに、蛍光ラベルしたチャネル形成ペプチド(Cy3-alamethicin)を人工膜に組み込み、蛍光とチャネル電流の同時測定を行った。ゆっくりと熱運動する輝点が観察され、同時に、膜を介して流れる電流が単一チャネルレベルで観察された。また、この人工膜にベシクル融合を用いて、チャネルタンパクを組み込むことも可能で、この膜を用いて、電気器官のACh受容チャネル、骨格筋のMaxi-Kチャネルを介した電流が、単一チャネルレベルで測定可能であった。

Research Products

• [Publications] T.Yanagida,K.Kitamura,H.Tanaka,A.H.Iwane & S.Esaki: "Single molecule analysis of the actomyosin motor"Current Opinion in Cell Biology. 12. 20-25 (2000)
• [Publications] T.Wazawa,Y.Ishii,T.Funatsu & T.Yanagida: "Spectral fluctuation of a single fluorophore conjugated to a protein molecule"Biophys.J.. 78. 1561-1569 (2000)
• [Publications] Y.Sako,S.Minoguchi & T.Yanagida: "Single-molecule imaging of EGFR signalling on the surface of living cells"Nature Cell Biology. 2. 168-172 (2000)
• [Publications] Y.Ishii,Y.Kimura,K.Kitamura,H.Tanaka,T.Wazawa & T.Yanagida: "Imaging and Nano-manipulation of Single Actomyosin Motors at Work"Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 27. 229-237 (2000)
• [Publications] T.Yanagida & A.H.Iwane: "A large step for myosin"PNAS.. 97. 9357-9359 (2000)
• [Publications] Y.Sako,K.Hibino,T.Miyauchi,Y.Miyamoto,M.Ueda & T.Yanagida: "Single-Molecule Imaging of Signaling Molecules in Living Cells"Single Molecules. 1. 159-163 (2000)