1分子機能イメージング顕微鏡の開発と細胞内情報伝達研究への応用

2001 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 12357001
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 柳田 敏雄 大阪大学, 医学系研究科, 教授 (30089883)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 岩根 敦子 大阪大学, 医学系研究科, 助手 (30252638) ; 佐甲 靖志 大阪大学, 医学系研究科, 助教授 (20215700)
• Keywords: 電気生理 / 人口膜 / チャネル / 全反射蛍光顕微鏡 / GPCR / CARI / CRAC

Research Abstract

細胞膜の情報伝達分子の反応を1分子可視化計測するための光学顕微鏡(1分子機能イメージング顕微鏡)を開発し、この方法を用いて、人工膜および細胞膜中で、チャネル1分子の構造変化とイオン透過機能の相関の解析、ホルモン受容体-G蛋白質チャネル分子間の情報伝達の1分子測定をおこなうことが本研究の目的である。
昨年、装置のプロトタイプが完成したので、本年度はこれを用いた情報伝達分子の反応の1分子計測を試みた。
(1)チャネル分子の構造変化とイオン透過の同時計測:1分子イメージング光学系に組み込み可能な電流測定系を構築した。ポリプロピレンシートに開けた小孔(直径約100mm)に形成した人工平面膜で、単一分子蛍光と単一チャネル電流を同時測定できた。蛍光標識抗体を用いてCa依存性Kチャネルを含むベシクルを蛍光標識し、平面膜に融合させてチャネル分子を膜に組み込んだ。膜中をブラウン運動する輝点が観察され、同時に膜を介し流れるCa依存性の陽イオン性電流が記録された。
(2)G蛋白質共役型受容体の情報伝反応の細胞内1分子測定:細胞性粘菌の走化性に関与する7回膜貫通型受容体CAR1と緑色蛍光蛋白質GFPの融合分子、および、CAR1の情報伝達に関与する細胞質蛋白質CRACとGFPの融合分子を細胞に発現させた。どちらの分子も細胞内で1分子イメージングが可能であった。CAR1が活性化すると細胞質のCRACが細胞膜へ局在変化することが知られている。今後は、両者の相互作用を細胞内で1分子検出するごとを目指す。

Research Products

• [Publications] Nishiyama, M. et al.: "Substeps within the 8-nm step of the ATPase cycle of single kinesin molecules"Nature Cell biology. 3. 425-428 (2001)
• [Publications] Y.Ishii et al.: "Single molecule nanomanipulation of bio molecules"Trends in Biotechnology. 19. 211-216 (2001)
• [Publications] Ishijima, A.Ynagida, T.: "Single molecule nano-biosaience"Trends in Biochemical Science. 26. 438-444 (2001)
• [Publications] Inoue, Y. et al.: "Motility of single one-headed kinesin molecules along microtubles"Biophysical Journal. 81. 2838-2850 (2001)
• [Publications] Aoki, T. et al.: "Non-contact electrostatic surface force imaging of single protein filaments using intermolecular force microscopy"Single Molecules. 2. 183-190 (2001)
• [Publications] Ueda, M. et al.: "Single molecule analysis of chemotactic signaling in Dictyostellum cell"Science. 294. 864-867 (2001)