2002 Fiscal Year Annual Research Report
1分子機能イメージング顕微鏡の開発と細胞内情報伝達研究への応用
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12357001
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
柳田 敏雄 大阪大学, 生命機能研究科, 教授 (30089883)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
岩根 敦子 大阪大学, 生命機能研究科, 助手 (30252638)
佐甲 靖志 大阪大学, 生命機能研究科, 助教授 (20215700)
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| Keywords | 電気生理 / 人工膜 / チャネル / 全反射 / 蛍光顕微鏡 / 1分子計測 / GPCR / 化学受容 |
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| Research Abstract |
細胞膜の情報伝達分子の反応を1分子可視化計測するための光学顕微鏡(1分子機能イメージング顕微鏡)を製作し、パッチ膜中で1分子光学測定と電流測定を同時に行う方法を開発した。この顕微鏡を用いて、人工膜および細胞膜中で、チャネル分子の構造変化とイオン透過の同時計測および、膜蛋白質とG蛋白質の相互作用の細胞内1分子測定をおこなった。
(1)チャネル分子の構造変化とイオン透過の同時計測:単一チャネルの開閉とリガンドの結合解離の同時計測をおこなった。心筋型リアノジン受容チャネルに特異的な抗体を蛍光色素Cy5で標識したものをチャネルに結合させて人工膜に再構成し、熱ゆらぎ運動を1分子計測した。同時に膜電位固定下で1分子開閉に伴うイオン電流ゆらぎを計測した。チャネルは熱ゆらぎ運動しながら開閉ゆらぎを行っていた。また、tip-dip法によりガラスピペット先端に作製した人工膜にアセチルコリンチャネルを組み込み、1分子イメージングと1分子電流計測を同時におこなうことに成功した。
(2)G蛋白質共役型受容体の情報伝反応の細胞内1分子測定:cAMPに誘起される細胞性粘菌の走化性に関与する7回膜貫通型受容体CAR1とcAMPの結合反応を蛍光cAMPをトレーサーとする1分子計測で解析した。溶液中のケージドcAMPを光解除してcAMPの濃度ジャンプを行うと数秒後に蛍光cAMPに対する受容体の親和性が一過的に上昇することが分かった。これは受容体にcAMPが結合するとさらに親和性が上昇するという正のフィードバック機構の存在を示唆している。
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[Publications] T.Ide, Y.Takeuchi, T.Yanagida: "Development of an Experimental Apparatus for Simultaneous Observation of Optical and Electrical Signals from Single Ion Channels"Single Molecules. 3. 33-42 (2002)
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[Publications] S.Nishikawa, K.Homma, Y.Komori et al.: "Class VI myosin moves processively along actin filament backwards with large steps"Biochem. Biophys. Res. Commun.. 290. 311-317 (2002)
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[Publications] H.Tanaka, K.Homma, A.H.Iwane et al.: "The motor doamin determines the large step of myosin-V"Nature. 415. 192-195 (2002)
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[Publications] M.Nishiyama, H.Higuchi, T.Yanagida: "Chemomechanical coupling of the ATPase cycle to the forward and backward movements of single kinesin molecules"Nature Cell Biology. 4. 790-797 (2002)
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[Publications] Ide T., Takeuchi Y., Aoki T., Yanagida T: "Simultaneous optical and electrical recording of a single ion-channel"Jpn J Physiol.. 52. 429-434 (2002)
