染色体DNAの走査プローブ顕微鏡試料の調製および遺伝子マッピングへの応用

2002 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 12450165
• Research Institution: Toyohastii University of Technology
• Principal Investigator: 水野 彰 豊橋技術科学大学, 工学部, 教授 (20144199)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 高島 和則 豊橋技術科学大学, 工学部, 教授 (60303707) ; 松澤 有希子 豊橋技術科学大学, 工学部, 助手 (10273335) ; 桂 進司 豊橋技術科学大学, 工学部, 助教授 (10260598)
• Keywords: マッピング / グロビュール / AFM / マイクロマニピュレーション / DNA伸張

Research Abstract

近年のゲノム科学の進展に伴い、ヒト各個人の遺伝子の相違を解析することが重要になっている。その手法として、核から遺伝子を損傷なく抽出し、既知の配列が遺伝子のどの位置にあるかを迅速に測定することで詳細に調べたい配列部分を同定し、解析する手法が考えられる。本研究では染色体DNAのグロビュール化ならびに基板への伸張固定法、固定したDNA上の制限酵素認識部位の計測を行った。
染色体クラスの巨大DNAを損傷無く物理操作するにあたって、DNAをランダムコイルからグロビュール状態に相転移させる方法がある。酵母の染色体DNAをゲル中に閉じ込める手法は確立されているが、そのDNAを溶液中に取り出す際に容易に断片化してしまう。そこでDNAを閉じこめたゲルをグロビユール化溶液に入れて加熱することでDNAの損傷を抑えつつ溶液中に回収することができた。
針電極先端に誘電泳動力で捕捉したグロビュール相転移したDNAを、溶液中でランダムコイルに相転移させながら伸張する方法では、グロビュール相転移バッファーにエタノール水溶液を用いることで針電極の損傷を押さえて伸張操作が可能になることが示された。また、新規のDNA伸張固定法として、DNAを含む溶液を一方向から凍結させることで基板上にDNAが伸張することを確認した。
また、遺伝子マッピングヘの応用として制限酵素を結合させたDNAのAFM観察を行った。マグネシウムイオンを排除した溶液で調製した試料で、DNA上に結合している制限酵素が確認できた。DNAの伸張にばらつきがあったものの、特異的な部位に制限酵素が結合していることが確認できた。
これらの技術を包括的に組み合わせることができれば、染色体レベルのDNAの遺伝子マッピング可能になると思われる。

Research Products

• [Publications] Jun Komatsu, Shunichi Matsuura, Michihiko Nakano, Kazunori Takashima, Shinji Katsura, Akira Mizuno: "Detection of restriction enzyme on the stretched DNA molecules by atomic force microscope"Proceedings ESA-IEJ Joint Meeting 2002. 26-31 (2002)