2002 Fiscal Year Annual Research Report
鳥類の性決定・性分化に関わるZ、W性染色体上の遺伝子の機能解明
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12460036
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| Research Institution | Nihon University |
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Principal Investigator |
水野 重樹 日本大学, 生物資源科学部, 教授 (90112903)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
荻原 淳 日本大学, 生物資源科学部, 助手 (50256830)
加藤 順 日本大学, 生物資源科学部, 講師 (80130467)
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| Keywords | ニワトリ / W染色体 / Z染色体 / Wpkci遺伝子 / PKCI遺伝子 / ZOV3遺伝子 / BACライブラリー / Wヘテロクロマチン |
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| Research Abstract |
1.ニワトリW染色体上のWpkci遺伝子、Z染色体上のPKCI遺伝子のタンパク質レベルの機能解析:Wpkci遺伝子は2000年に水野(当時、東北大学)とA.Sinclair(メルボルン大学、ASW遺伝子という名前で)のグループで独立に発見した。水野らは同時に関連遺伝子PKCIをZ染色体上に発見した。これらは、機能的に異なると予想されるドメインをコードすること、生殖腺分化前の初期胚で高発現することから、性決定への関与が予想されるが、タンパク質レベルの研究はなされていなかった。本年度はそれぞれのcDNAクローンから酵母や大腸菌でタンパク質を発現させる条件を検討した結果、WpkciはN末にマルトース結合タンパク質、C末にHisタグを付加した形で、PKCIはN末にグルタチオン-S-トランスフェラーゼ、C末にFLAGタグを付加した形で大腸菌で発現精製することができた。また、PKCIのC末側のHITドメインとWpkciの相当領域はアミノ酸配列として27%の相同性を示すのみであることから、これらの領域に対する抗ペプチド抗体をウサギで作製、アフィニテイー精製し、大腸菌で発現したそれぞれのタンパク質に特異的に反応することを示した。このようにタンパク質レベルの研究を進める準備が整った。
2.ニワトリZ染色体上のZOV3遺伝子は水野グループで1993年に発見した免疫グロブリンスーパーファミリー遺伝子で、ステロイドホルモン生産細胞の細胞膜貫通タンパク質として発現することを1997年に示したが、その遺伝子機能はこれまで明らかにされていない。本研究では、まず、RT-PCR法で発現組織を再確認した結果、卵巣卵胞の顆粒膜細胞、きょう膜組織中の細胞で高発現するほか、未成熟の精巣や副腎でもある程度発現することが示された。そこで、一次培養可能な卵胞顆粒膜細胞での発現特異性を転写レベルで調べるためBACライブラリーからZ0V3遺伝子クローンを取得して大部分のエキソン、イントロン配列と第1エキソンの上流域約2.5kbの塩基配列を決定した。異なった上流域配列をプロモーターを含まないCFPレポーター遺伝子発現ベクターの遺伝子上流域に挿入して、顆粒膜細胞の一次培養系に導入して転写活性化領域を特定する実験を開始している。
3.水野グループで1998年にcDNAクローニングしたニワトリのクロモボックスタンパク質CHCB1がWヘテロクロマチンの構築にいかに関わるかを追求するため、雌ニワトリ赤血球の核からオリゴヌクレオソームを単離し、これにHisタグ付加CHCB1を結合させる条件を検討した。結合後、クロマチン免疫沈降法を適用して、結合画分にXholファミリー配列が濃縮されるか、N末から9番目のリジン残基のメチル化されたヒストンH3が濃縮されるかを検討している。
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[Publications] J.Kato: "Efficient selection of genomic clones from a female chicken bacterial artificial chromosome library by four-dimensional polymerase chain reactions"Poultry Science. 81. 1501-1508 (2002)
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[Publications] Yuichiro Itoh: "Molecular and cytological characterization of Sspl-family repetitive sequence on the chicken W chromosome"Chromosome Research. 10. 499-511 (2002)
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[Publications] Akira Chiba: "External features and molecular sexing of the anomalous Pintail, Anas acuta, found at Hyo-ko Waterfowl Park, Niigata Prefecture, Japan"Ornithological Science. 1. 167-170 (2002)
