高度好熱菌の遺伝子組換えシステムを利用した超好熱菌遺伝子機能の解析と利用

2002 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 12460038
• Research Institution: University of Tsukuba
• Principal Investigator: 星野 貴行 筑波大学, 応用生物化学系, 教授 (80219170)
• Keywords: Thermus thermophilus / Pyrococcus horikoshii / expression vector

Research Abstract

超好熱性古細菌 Pyrococcus horikoshii OT3株の6遺伝子(aminopeptidase, threonine dehydrogenase, glutamate dehydrogenase, carboxypeptidase, endoglucanase,α-mannosidase)について、Thermus thermophilusの宿主・ベクター系を用いた発現を試みた。上記6遺伝子は、大腸菌を用いた場合には、発現レベルが低かった遺伝子である。従来型の発現ベクターを用いた場合には、すべての遺伝子の発現レベルが極めて低かったが、ベクターのプロモーターを強力なものに置換することによって、発現レベルの上昇が認められた。S-layer遺伝子のプロモーター(Pslp)を用いた場合に最高レベルの発現が確認され、それまで大腸菌では全く活性が認められていなかったα-mannosidase遺伝子の活性も明確に認められた。しかし、他の遺伝子の発現レベルは大腸菌での発現レベルに比べて低いものであった。そこで、aminopeptidase, threonine dehydrogenase, glutamate dehydrogenaseの発現系で、超好熱菌由来のシヤペロニン遺伝子の共発現を試みたところ、aminopeptidase, glutamate dehydrogenaseの2遺伝子で4倍程度の活性上昇が確認された。
T.thermophilusでの超好熱菌遺伝子の更なる高発現を目指して、ベクターの多コピー化についても検討した。その結果、従来型ベクターのコピー数を数倍に増大させる因子を明らかにした。また、低分子多コピーベクターの開発も行った。

Research Products

• [Publications] Wulandari, A.P., Miyazaki, J., Kobashi, N.Nishiyama, M., Hoshino, T., Yamane, H.: "Characterization of bacterial homocitrate synthase involved in lysine biosynthesis"FEBS Letters. 522(1-3). 35-40 (2002)