2001 Fiscal Year Annual Research Report
疎水性物質排出ポンプを構成するAcrBの機能改変による大腸菌の有機溶媒耐性の向上
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12460042
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| Research Institution | Tokyo Institute of Technology |
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Principal Investigator |
青野 力三 東京工業大学, 大学院・生命理工学研究科, 教授 (30126643)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
道久 則之 東京工業大学, 大学院・生命理工学研究科, 助手 (60302957)
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| Keywords | 大腸菌 / 有機溶媒耐性 / AcrAB-TolC排出ポンプ / sox-marレギュロン |
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| Research Abstract |
大腸菌のAcrAB-TolCポンプは、sox-marレギュロンに属するacrABオペロンとtolC遺伝子とによってコードされる、本ポンプはプロトン駆動力によって駆動され、細胞内に取り込まれた薬剤および有機溶媒分子などの疎水性異物を排出する。その結果、大腸菌の多剤耐性および有機溶媒耐性に寄与している。AcrAB-TolCポンプは、内膜に存在するAcrBタンパク、ペリプラズムに存在するAcrAタンパク、外膜に存在するTolCタンパクによって構成されている。野生型AcrAB-TolCポンプによる有機溶媒排出活性を調べたところ、ヘプタンに対する排出活性が最も高いことが認められた。本ポンプの基質特異性を決定しているのはトランスポーターAcrBタンパク質であると推定され、acrB遺伝子に対して変異処理を施すことによってAcrBタンパクの有機溶媒排出機能を向上させることが可能であることが期待される。
クローニングしたacrAB遺伝子に対して、DNAシャッフリング法(acrB遺伝子のパラログあるいはホモログ遺伝子の断片を鋳型として用いるファミリーシャッフリング法)およびerror prone PCRによりacrB遺伝子にランダム変異を導入した。変異処理を施したacrB遺伝子により大腸菌acrB欠失株を形質転換し、形質転換体の有機溶媒耐性を調べた。その結果、野生型大腸菌と比べて溶媒耐性が様々な程度に低下したクローンが得られた。このことは、有機溶媒排出機能が変化した変異AcrBが構築された可能性を示唆する。これらの変異体の排出活性を詳細に検討することと変異部位を特定することによって、AcrBの機能部位を同定することが可能となる。しかし、これまでに溶媒排出機能が向上したと考えられる変異株はまだ構築できていない。
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[Publications] Norihiko Tsukagoshi: "Entry into and release of solvents by Escherichia Coli in an organic aqueous two-liquid phase system and substrate specificity of the AcrAB-TolC solvent-extruding pump"Journal of Bacteriology. 182. 4803-4810 (2000)
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[Publications] Rikizo Aono: "Evaluation of the growth inhibition strength of hydrocarbon solvents against Escherichia coli and Pseudomonas putida grown in a two-liquid phase culture system consisting of a medium and organic solvent"Extremophiles. 5. 11-15 (2001)
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[Publications] Kei Kobayashi: "Suppression of the hypersensitivity of Escherichia coli acrB mutant to organic solvents by integrational activation of the acrEF operon with the IS1 or IS2 element"Journal of Bacteriology. 183. 2646-2653 (2001)
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[Publications] Noriyuki Doukyu: "Cloning, sequence analysis and expression of a gene encoding an organic solvent- and detergent-tolerant cholesterol oxidase of Burkholderia cepacia strain ST-200"Applied Microbiology and Biotechnology. 57. 146-152 (2001)
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[Publications] Noriyuki Doukyu: "Isolation of an Acinetobacter sp. ST-550 which produces a high level of indigo in a water-organic solvent two-phase system containing high levels of indole"Applied Microbiology and Biotechnology. 58(印刷中). (2002)
