疎水性物質排出ポンプを構成するAcrBの機能改変による大腸菌の有機溶媒耐性の向上

2002 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 12460042
• Research Institution: Tokyo Institute of Technology
• Principal Investigator: 道久 則之 東京工業大学, 大学院・生命理工学研究科, 助手 (60302957)
• Keywords: 大腸菌 / 有機溶媒耐性 / AcrAB-TolC排出ポンプ / sox-marレギュロン

Research Abstract

大腸菌のACrAB-TolCポンプは、sox-marレギュロンに属するacrABオペロンとtolC遺伝子とによってコードされる。本ポンプはプロトン駆動力によって駆動され、細胞内に取り込まれた薬剤および有機溶媒分子などの疎水性異物を排出する。その結果、大腸菌の多剤耐性および有機溶媒耐性に寄与している。AcrAB-TolCポンプは、内膜に存在するAcrBタンパク、ペリプラズムに存在するAcrAタンパク、外膜に存在するTolCタンパクによって構成されている。野生型AcrAB-TolCポンプによる有機溶媒排出活性を調べたところ、ヘプタンに対する排出活性が最も高いことが認められた。本ポンプの基質特異性を決定しているのはトランスポーターAcrBタンパク質であると推定され、acrB遺伝子に対して変異処理を施すことによってAcrBタンパクの有機溶媒排出機能を向上させることが可能であることが期待される。
クローニングしたacrAB遺伝子に対して、DNAシャッフリング法(acrB遺伝子のパラログあるいはホモログ遺伝子の断片を鋳型として用いるファミリーシャッフリング法)およびerror prone PCRによりacrB遺伝子にランダム変異を導入した。変異処理を施したacrB遺伝子により大腸菌acrB欠失株を形質転換し、形質転換体の有機溶媒耐性を調べた。その結果、野生型大腸菌と比べて溶媒耐性が様々な程度に低下したクローンが得られた。このことは有機溶媒排出機能が変化した変異AcrBが構築された可能性を示唆する。また、AcrABのホモログタンパク質を調べることにより、AcrAB-TolCよりも有機溶媒耐性を向上させるポンプを検索した。この結果、AcrAB-TolCポンプは幾つかのホモログタンパク質よりも溶媒耐性度を向上させる効果が大きいことが示された。

Research Products

• [Publications] Noriyuki Doukyu: "Isolation of an Acinetobacter sp. ST-550 which produces a high level of indigo in a water-organic solvent two-phase system containing high levels of indole"Applied Microbiology and Biotechnology. 58. 543-546 (2002)
• [Publications] Noriyuki Doukyu: "Indigo production by Escherichia coli carrying phenol hydroxylase gene from Acinetobacter sp. strain ST-550 in a water-organic solvent two phase system"Applied Microbiology and Biotechnology. 60. 720-725 (2003)