2001 Fiscal Year Annual Research Report

水産動物の細胞死過程における生物学的および化学的応答に関する研究

Research Project

Project/Area Number	12460092
Research Institution	東京水産大学
Principal Investigator	山中英明東京水産大学, 水産学部, 教授 (20092596)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	潮秀樹東京水産大学, 水産学部, 助教授 (50251682) 齋藤洋昭 (独)水産総合研究センター, 中央水産研究所, 室長大島敏明東京水産大学, 水産学部, 助教授 (70134856)
Keywords	脂質過酸化 / リン脂質 / 細胞死 / ミトコンドリア / 膜電位 / 化学発光 / 蛍光
Research Abstract	水産動物でも,個体死の後も細胞はしばらくの間生体活動を続けようとする.したがって,この間の取扱がその後の死後変化に大きな影響を及ぼす可能性がある.昨年度研究では水産動物の個体死から細胞死に至る過程で生じる生物学的・化学的変化をモニターする手法を確立した.そこで,本年度研究では,これらの手法を用いて生物学的・化学的変化をモニターすることにより,細胞死過程における動的変化の発現機構の解明を目指した.まず,生物学的アプローチとして急性摘出した魚類筋細胞ミトコンドリアおよび甲殼類筋細胞ミトコンドリアに膜電位感受性蛍光プローブJC-1あるいはrhod amine123を取り込ませてミトコンドリア膜電位の評価を行った.急性摘出したコイの筋細胞にJC-1を取り込ませた後,4時間まで窒素曝気したリンゲル液中においたところ,経時的に蛍光強度が減弱した.これは,低酸素状態に置かれたミトコンドリアの膜電位が低下し,ATP産生能も低下していることを示す.この細胞を十分に空気曝気したリンゲル液に戻すとミトコンドリアの蛍光が回復した.すなわち,コイ筋細胞は4時間もの間低酸素状態に置かれても少なくともミトコンドリアレベルでは生命維持活動が可能であることを示すものと思われる.また,イセエビ筋細胞にRohdamine123を投与し,ミトコンドリアに取り込ませた後,リンゲル液に十分通気しておけばミトコンドリア膜電位が少なくとも24時間以上維持される可能性が示された.このように,ミトコンドリアの膜電位およびその回復能をもって生命維持活性の評価ができるものと考えられた.さらに,12年度に確立した化学発光HPLCフローシステムを用いて,活魚の鮮度変化について検討した.ヒラメやマダイなどを即殺後,普通筋,血合筋,肝臓などの部位に分け,ホモジネート後、0℃で保存試験を行った.経時的にFolchの方法に準じて全脂質を抽出し,低温下で溶媒を留去後,過酸化物の定量分析を行った.HPLCフローシステムによる測定では,筋肉脂質よりも肝臓脂質の方が高い傾向が示されたが,リン脂質過酸化物の定量に再現性が乏しく,時間経過との相関はみられなかった.原因は全脂質中のリン脂質画分の低濃度にあると推定された.14年度には,試料調製の際,極性脂質を分画し,高濃度リン脂質ヒドロペルオキシドとして測定することを試みる.また,素材は血合筋の割合の大きいアジ科魚類で試みる予定である. 次年度からはこれらの手法を用いて生物学的・化学的変化をモニターすることにより,細胞死過程における動的変化の発現機構の解明を目指す.