動物腸管付着性プロバイオティック乳酸菌の選抜・作出システムの構築とその応用

2000 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 12460117
• Research Institution: Tohoku University
• Principal Investigator: 齋藤 忠夫 東北大学, 大学院・農学研究科, 助教授 (00118358)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 川井 泰 東北大学, 大学院・農学研究科, 助手 (00261496) ; 北澤 春樹 東北大学, 大学院・農学研究科, 助手 (10204885)
• Keywords: ヒト腸管 / プロバイオティック / 乳酸菌 / アシドフィルス菌 / 付着性 / アドヘシン / 遺伝子導入 / 遺伝子改変

Research Abstract

本年度には、既に当研究室において確立された「高ヒト腸管付着性プロバイオティック乳酸菌の選抜システム」を用いて、L.acidophilus LA2,LA187(研究室での乳児糞便単離株)およびJCM267(購入株)の3菌株を優れたヒト腸管付着性を有する菌株として選抜した。これらの菌株は、「カルノア固定切片法」によりヒト腸管粘液結合性を確認した。また、選抜菌体より塩酸グアニジン抽出法により細胞表層タンパク質(SLP)を調製した。ヒト大腸ムチンの代替品であるラット大腸ムチン(RCM)を調製し、これを塗布したPVDF膜(これを疑似ヒト大腸粘膜と考える)と、選抜菌の細胞表層タンパク質とを37℃下で温和な親和反応させた。膜に特異的に結合した特定のアドヘシン分子を回収し、付着に関与した主要成分の単離精製を行い、アミノ酸組成分析、N-末端分析、C-末端分析、分子量、等電点測定などの生化学的検討を行い、特性解析を終了した。L.acidophilus LA2株の20KDaレクチン様タンパク質のN-末端配列分析情報からDNAプローブを合成し、大腸菌の遺伝子組み替え法を用いたクローニングにより構造遺伝子の全塩基配列を決定した。構造遺伝子を発現ベクターに導入し、大腸菌により融合タンパク質法でアドヘシンの大量発現を行い、糖鎖認識性の検討を通して、付着機構の部分的な解明を行った。さらにこの高付着性アドヘシン遺伝子の導入により、低付着性有用菌表層構造を遺伝子改変し、付着性因子を新たに菌体表層に発現させた高付着性アシドフィルス菌を作出を試みている。本年度の成果により、アドヘシン遺伝子を細胞接着性の弱い他のアシドフィルス菌に対して遺伝子導入し、新たな接着性を有する乳酸菌の作出という本年度の成果到達目標は達成出来た。