超微量ガラス化法による卵母細胞および受精卵の万能凍結保存システムの開発

2001 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 12460126
• Research Institution: Kochi University
• Principal Investigator: 葛西 孫三郎 高知大学, 農学部, 教授 (60152617)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 杉本 実紀 京都大学, 大学院・農学研究科, 助手 (20243074) ; 枝重 圭祐 高知大学, 農学部, 助教授 (30175228)
• Keywords: 受精卵 / 胚 / 卵母細胞 / 凍結保存 / ガラス化 / 透過性 / 水チャンネル / 耐凍剤

Research Abstract

1.細胞内凍結を防ぐ効果があると考えられる超急速ガラス化法を用いて、マウス未受精卵の適する凍結保存条件を検討した結果、ストロー付着法やマイクロドロップ法で凍結した卵子の生存率は低かったが、クライオループ法では、ストロー充填法と同様の高い生存率が得られた。しかし、ストロー充填法と同様に、10%エチレングリコール、EFS20、EFS40による3段階の処理が必要であった。ストロー充填法を用いて、ガラス化溶液について検討した結果、30%エチレングリコールと10%アセトアミドを加えた溶液でも高い生存率が得られた。凍結保存したマウス卵子を体外受精した結果、透明帯を除去した場合には高い受精率が得られたが、透明帯を除去しなかった場合には、受精率が低下した。しかし、アセトアミドを含むガラス化溶液を用いた場合には、比較的高い受精率が得られた。
2.細胞を生きたまま凍結保存するためには、細胞内外へ水と耐凍剤が速やかに透過することが必要である。卵子や胚は発育段階によって耐凍性が異なることが知られており、マウス卵子・胚を用いて、膜透過性に違いがあるかどうか調べた。その結果、水透過係数は、未受精卵と4細胞期胚では低かったが、桑実胚と胚盤胞では著しく高かった。また、グリセロール透過係数も同様に、未受精卵と4細胞期胚では低く、桑実胚以降の胚では著しく高かった。水透過に対する温度依存性を調べた結果、未受精卵では高く、桑実胚では低かった。この結果から水や耐凍剤は、耐凍性が低い未受精卵や4細胞期胚では主に脂質二重膜を介した単純拡散によってゆっくり透過しているのに対し、耐凍性の高い桑実胚以降の胚では、主にチャンネルを介して速やかに透過していると考えられた。

Research Products

• [Publications] Shaw, Jillian M.: "Embryo cryopreservation for transgenic mouse lines"Methods in Molecular Biology. 158. 397-419 (2001)
• [Publications] Mukaida, Tetsunori: "Successful birth after transfer of vitrified human blastocysts with use of a cryoloop containerless technique"Fertility and Sterility. 76・3. 618-620 (2001)
• [Publications] Kasai, Magosaburo: "Insights into the cryoprotective mechanism of saccharides in the freezing of mouse spermatozoa"Reproductive Biotechnology. 313-318 (2001)
• [Publications] An, Tie Zhu: "Viability of spermatozoa recovered from mouse carcasses"Reproductive Biotechnology. 327-331 (2001)
• [Publications] Kasai, Magosaburo: "Advances in the cryopreservation of mammalian oocytes and embryos : Development of ultrarapid vitrification"Reproductive Medicine and Biology. 1・1. 18-26 (2002)